Informace

10.2: Nomenklatura plazmidů - Biologie

10.2: Nomenklatura plazmidů - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pro rozlišení plazmidů je důležitá správná nomenklatura. V našich experimentech:

pANO2.1-MET1 by určilo S. cerevisiae MET1 gen klonovaný do pYES2.1.

pYES2.1-Met1 by určil S. pombe Met1 gen klonovaný do pYES2.1. (Připomeňme si to z kapitoly 6 S. cerevisiae geny jsou neobvyklé v používání 3 velkých písmen pro jejich jména.)

pANO2.1 -lacZ+ by označil bakteriální gen LacZ klonovaný do pYES2.1. (Poznámka: názvy bakteriálních genů nejsou velké. Znaménko plus označuje gen divokého typu.)

Poznámka

Ortolog S. pombe genu S. cerevisiae nemusí sdílet stejné číslo genu. Mnoho z S. pombe geny dostaly svá jména díky jejich homologii s dříve identifikovanými S. cerevisiae geny, ale některé S. pombe geny byly pojmenovány dříve, než byly známy jejich sekvence DNA. Například ortholog of S. cerevisiae MET2 v S. pombe je Met6.

​​​​​


10.2: Plazmidová nomenklatura - biologie

Všechny články publikované společností MDPI jsou okamžitě k dispozici po celém světě pod licencí otevřeného přístupu. K opětovnému použití celého nebo části článku publikovaného MDPI, včetně obrázků a tabulek, není vyžadováno žádné zvláštní povolení. U článků publikovaných pod licencí Creative Common CC BY s otevřeným přístupem může být jakákoli část článku znovu použita bez povolení za předpokladu, že je původní článek jasně citován.

Feature Papers představují nejpokročilejší výzkum s významným potenciálem velkého dopadu v této oblasti. Příspěvky jsou předkládány na základě individuálního pozvání nebo doporučení vědeckých redaktorů a před zveřejněním procházejí vzájemným hodnocením.

Feature Paper může být buď původní výzkumný článek, podstatná nová výzkumná studie, která často zahrnuje několik technik nebo přístupů, nebo komplexní přehledový dokument se stručnými a přesnými aktualizacemi o nejnovějším pokroku v této oblasti, který systematicky hodnotí nejzajímavější pokroky ve vědě literatura. Tento typ papíru poskytuje výhled na budoucí směry výzkumu nebo možné aplikace.

Články Editor’s Choice vycházejí z doporučení vědeckých redaktorů časopisů MDPI z celého světa. Editoři vybírají malý počet článků nedávno publikovaných v časopise, o kterých se domnívají, že budou pro autory obzvláště zajímavé nebo důležité v této oblasti. Cílem je poskytnout snímek některé z nejzajímavějších prací publikovaných v různých oblastech výzkumu časopisu.


Nová nomenklatura a klasifikační schéma pro neuronální ceroidní lipofuscinózy

Poskytujeme novou klasifikaci neuronálních ceroidních lipofuscinóz (NCL), která zohledňuje nedávné genetické a biochemické pokroky. Toto bylo původně vyvinuto mezinárodní skupinou s klinickými, molekulárně genetickými, biologickými a morfologickými zájmy, dále revidováno panelem světových odborníků v NCL a nyní je aktualizováno s ohledem na nedávná zjištění výzkumu. Cílem je poskytnout mladým lidem, pečovatelům a profesionálům diagnostický štítek, který je informativní, povede k efektivnímu klinickému zvládnutí symptomů a v budoucnu možná i vyléčení, a také pomůže základnímu vědeckému a klinickému výzkumu. Navrhujeme, aby se kliničtí lékaři snažili poskytnout každému dítěti a rodině podrobné diagnostické informace na klinické, biochemické a genetické úrovni tam, kde je to možné, což nová klasifikace umožňuje hierarchicky vedeným genem. Robustnost a použitelnost této aktualizované nové klasifikace byla nezávisle auditována v klinickém prostředí s použitím řady pacientů, u kterých byla dříve diagnostikována NCL podle standardních ultrastrukturálních, biochemických nebo genetických kritérií.


Virová integrace

Jako součást svého lysogenního cyklu se AAV divokého typu integruje do genomu hostitele na specifickém místě, AAVS1 na lidském chromozomu 19. Toto místo je oblíbené kvůli přítomnosti vazebného prvku Rep, nicméně k náhodné integraci může dojít mnohem méně frekvence. Jako replikačně nekompetentní virus nemůže AAV vstoupit do lytického cyklu bez pomoci. Pro aktivaci lytického cyklu je nezbytný další virus, jako je adenovirus nebo virus herpes simplex, nebo genotoxické činidlo, jako je UV záření nebo hydroxymočovina.

Když je pro výzkumné účely použit rekombinantní AAV (rAAV), je dodáván protein Rep v trans eliminující schopnost rAAV integrovat se do jeho preferovaného místa genomové integrace na lidském chromozomu 19, nazývaného AAVS1. Místo toho je genom rAAV typicky zpracován na dvouvláknový kruhový epizom pomocí dvouvláknové syntézy. Tyto epizomy se mohou konkatemerizovat a produkovat struktury s vysokou molekulovou hmotností, které jsou udržovány extrachromozomálně. rAAV je pravděpodobnější, že než AAV divokého typu se integrují na nehomologních místech v genomu, a činí to přibližně s 0,1% frekvencí. Předpokládá se však, že většina částic rAAV je udržována v epizomech nebo concatemerech.

Epizomy se výrazně liší od virových částic produkovaných během lytického cyklu. rAAV epizomy mohou vyvinout organizaci podobnou chromatinu a přetrvávat v nedělících se buňkách po dobu let, aniž by došlo k poškození hostitelské buňky. Naproti tomu virové částice produkované během lytického cyklu se rychle uvolňují buněčnou lýzou. Epizomální stabilita umožňuje dlouhodobou expresi transgenu v nedělících se buňkách a je klíčovou výhodou rAAV.


Aplikace metylace při zlepšení transformace plazmidu na Helicobacter pylori

Helicobacter pylori je důležitý gastrointestinální patogen. Jeho kmeny mají různé úrovně výkonných restrikčních modifikačních systémů, které jsou významnými překážkami pro genetické nástroje používané pro studium role funkčních genů v jeho patogenezi. Methylační vektory in vitro byly popsány jako alternativa k překonání této bariéry u několika bakterií. V této studii jsme použili dva H. pylori-E. coli shuttle plasmidy a několik jedno/dvojitě zkřížených homologních rekombinačních plazmidů zacílených na gen, k testování role methylace v transformaci H. pylori. Podle našich výsledků bylo možné transformanty získat pouze poté, co byly před transformací methylovány kyvadlové plazmidy. Pomáhá při genové komplementaci a nadměrné expresi, i když na nízké frekvenci. Po methylaci byla také zvýšena frekvence transformace cílení genu, zejména u jednokřížových rekombinačních plazmidů, jejichž transformanty bylo možné získat až po methylaci. U plazmidů zaměřených na dvojitě zkříženou rekombinaci byl počáteční výtěžek transformantů 0,3-0,8 × 102 CFU na mikrogram plazmidové DNA. S pomocí methylace byl výtěžek zvýšen na 0,4-1,3 x 102 CFU na mikrogram plazmidové DNA. Tyto výsledky naznačují, že metylace in vitro může zlepšit transformaci H. pylori různými plazmidy, což bude přínosem pro výzkum patogenního mechanismu.

Klíčová slova: Methylační transformace plazmidu Helicobacter pylori.


Metody

Molekulární biologie

Fragmenty PCR byly vytvořeny pomocí Phusion DNA Polymerase (Finnzymes) nebo Taq Plus Precision (Stratagene). Primery a šablony jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1 a v doplňkových metodách. Tyto fragmenty, včetně regulačních prvků, byly klonovány do vektoru pGEM-T (Promega). Fragmenty byly z těchto vektorů nařezány pomocí SapI (LguI), izolovány z agarózových gelů TAE, purifikovány pomocí soupravy pro extrakci gelem Qiaquick (Qiagen) a poté skladovány při -20 ° C. Donorové a akceptorové vektory byly vytvořeny v jediném ligačním kroku osmi fragmentů (doplňkový obrázek S1). Konsensuální sekvence a názvosloví těchto plazmidů jsou uvedeny na doplňkovém obrázku S2. Dostupné donorové a akceptorové vektory jsou uvedeny na doplňkovém obrázku S3. Plazmidy obsahující počátek replikace pUC byly propagovány v buňkách TopTen nebo DH10β a plazmidy s počátkem replikace R6Kγ v pir+ buňky 6 . Dotyčné geny byly klonovány do donorových a akceptorových vektorů pomocí T4 DNA ligázy nebo SLIC 12. Všimněte si, že existující expresní vektory z typu pcDNA (Invitrogen) nebo pEGFP (Clontech) mohou být amplifikovány standardními primery a vloženy do požadované páteře (doplňkový obrázek S4). The Cre/LoxP rekombinační reakce byla prováděna při 37 ° C po dobu 60 minut (New England BioLabs). Doporučujeme použít plasmidy, které byly čištěny metodou aniontové výměny. V jediném kroku lze rutinně sestavit tři plazmidy. Čtvrtý nebo pátý plazmid může být vložen sekvenčním způsobem a měly by být použity vysoce kompetentní buňky. Všimněte si, že existují dvě možnosti pro sestavení tří plazmidů, šest možností pro sestavení čtyř plazmidů a 24 možností pro sestavení pěti plazmidů. Nečištěná reakční směs Cre byla použita k transformaci buněk DH10p nebo TopTen elektroporací. Transformační účinnost fúzí obsahujících čtyři nebo pět plazmidů byla optimalizována kultivací transformovaných buněk přes noc při 30 °C v kapalné kultuře obsahující vhodná antibiotika před nanesením a/nebo použitím vysoce kompetentních komerčních buněk. Plazmidy by měly být analyzovány štěpením restrikčními enzymy. Antibiotika byla použita v následujících koncentracích pro sestavy 1–3 plazmidů: ampicilin, 50 μg μl −1 kanamycin, 25 μg μl −1 spektinomycin, 50 μg μl −1 chloramfenikol, 4 μg a μg μlamy−l. 1. Koncentrace antibiotik byly sníženy na 50 %, když byly sestaveny čtyři nebo pět plazmidů. Přeuspořádání nebo denaturace plazmidů během růstu byla eliminována kultivací bakterií v médiu Luria-Bertani (LB) při 30 ° C spíše než použitím 2 × YT při 37 ° C.

Buněčná kultura

Buňky HEK293 a COS byly udržovány při 37 ° C s 5% CO2 v DMEM (Amimed) obsahující 10% fetální telecí sérum (Amimed), 100 jednotek ml −1 penicilin a 100 μg ml −1 streptomycin (Invitrogen). HAM-F12 (Amimed) byl použit místo DMEM pro endoteliální buňky prasečí aorty. Buňky byly transfekovány Fugene HD (Roche) nebo fosforečnanem vápenatým. Když byla hladina exprese příliš vysoká, byly plazmidy MultiLabel zředěny nosnými plazmidy (1:3 nebo 1:5). Stabilní buněčné linie byly generovány systémem Flp-In podle doporučení výrobce (Invitrogen) nebo náhodnou integrací linearizovaných plazmidů. Selekce byla provedena s následujícími antibiotiky a koncentracemi: G418, 16 μg ml −1 (Calbiochem) hygromycin, 50 μg ml −1 (Roche) zeocin, 100 μg μl −1 (Invitrogen). Naváděcí endonukleázy byly získány od New England Biolabs.

Mikroskopie

Buňky byly naneseny na skleněná krycí sklíčka, kultivovány po dobu 40 hodin a poté fixovány 4% formaldehydem (buď přímo v kultivačním médiu nebo v PBS). Vzorky byly třikrát promyty PBS a poté připevněny pomocí Citifluor AF1. Zobrazování bylo provedeno na laserovém skenovacím konfokálním mikroskopu Leica SP5 nebo na Olympusu IX81 vybaveném kamerou Andor iXon EM (doplňkový film 1). Emisní okna fluorescenčních proteinů byla definována konstruktem exprimujícím pět nepřekrývajících se subcelulárních markerů značených fluorescencí. EBFP2 byl excitován laserovou linkou 405 nm a emise byly shromažďovány od 430 do 450 nm (405/430–450). Ostatní fluorescenční proteiny byly analyzovány následovně: mTFP1 (458/485–510) mCitrine (514/525–545) mCherry (543/585–620) mPLUM (633/640–800). Kromě toho byl k ověření přítomnosti všech fluorescenčních proteinů použit spektrální režim (xyλ) mikroskopu (data nejsou uvedena). Kvantifikace byla provedena pomocí softwaru LAS AF (Leica Microsystems). Figurky byly zpracovány pomocí softwaru Photoshop nebo Imaris (Bitplane). Pro zvýšení viditelnosti vezikul byl použit Gaussův filtr, jas a kontrast včetně nastavení gama. Všechny operace byly provedeny na celé sadě snímků.

Western blot

Buňky HEK293 byly naneseny na 6 cm misky s hustotou 50% 1 den před transfekcí. Buňky byly transfekovány FugeneHD podle doporučení výrobce (Roche) a lyžovány o 40 hodin později lyzačním pufrem (0,5% Triton X-100, 50 mM Tris – HCl, 100 mM NaCl). Supernatant byl použit pro western blot po sonifikaci a centrifugaci. Použitými protilátkami byly králičí anti-EGFR (Neomarkers, RB-1417, zředěný 1: 1 000 ve 3% BSA/TBST) a myší anti-myc-tag (9E10, zředěný 1: 5 ve 3% BSA/TBST). Jako sekundární protilátky, kozí anti-myš spojená se zásaditou fosfatázou (Southern Biotech, 1031-04, zředěná 1: 10 000 v 3% sušeném mléce/TBST) a anti-králičí (Southern Biotech, 4050-04, zředěná 1: 10 000 ve 3 % sušeného mléka/TBST) byly použity protilátky, následovala detekce chemiluminiscenem.


3 Hlavní klasifikace vektorů (s diagramem)

Jde o to, na co cílíme z našeho genu, který nás zajímá – jeho více kopií nebo jeho proteinový produkt.

V závislosti na těchto kritériích jsou vec­tor následující dva typy:

1. Klonovací vektory:

Klonovací vec & shytor používáme, když je naším cílem získat pouze početné a plaché kopie (klony) našeho požadovaného genu (odtud název klonovacích vektorů). Ty se většinou používají při konstrukci genových knihoven. Jako zdroje pro klonovací vektory lze použít řadu organismů.

Některé jsou vytvořeny synteticky, jako v případě kvasinkových umělých chromozomů a bacte & shyrial umělých chromozomů, zatímco jiné jsou převzaty z bakterií a bakteriofů a shygeů. Ve všech případech musí být vektor geneticky modifikován, aby bylo možné izolovat a shydatovat cizí DNA vytvořením místa in & shysertion, kde se nová DNA vejde a bude stydět. Příklad: klonovací vektory PUC, klonovací vektory pBR322 atd.

2. Výrazové vektory nebo výrazová konstrukce:

Expresní vektor používáme, když je naším cílem získat proteinový produkt našeho sledovaného genu. Abychom získali pro­tein, musíme umožnit expresi našeho genu, který nás zajímá (odtud název expresní­sion vektor) využitím procesů transkripce a translace.

Kromě tří sekvencí DNA diskutovaných výše (počátek replikace, selektovatelné markery a více klonovacích míst) mají expresní vektory také několik dalších speciálních sekvencí.

A. Bakteriální promotor, jako je lac promotor. Promotor předchází restrikčnímu místu, kam má být vložena cizí DNA, což umožňuje regulaci transkripce cizí sekvence přidáním látek, které indukují pro & shymoter.

b. Sekvence DNA, která, když je transkriptována do RNA, produkuje prokaryotické vazebné místo pro ribozomy.

C. Sekvence iniciace a terminace prokaryotické transkripce.

d. Sekvence, které řídí iniciaci transkripce, jako jsou regulační geny a operátory.

V některých typech expresních vektorů, které se specificky používají ve spojení s bakteriálním hostitelem (jako E. coli), mnohočetné klonovací místo bezprostředně nesousedí s vazebnou sekvencí riboshysomu, ale místo toho mu předchází speciální sekvence kódující bakteriální polypeptid.

Při použití takového typu expresních a shysiových vektorů je požadovaný gen vložen těsně za gen pro bakteriální polypeptid. Tímto způsobem spojíme dva čtecí rámce a vytvoříme hybridní gen, který začíná bakteriálním genem a postupuje bez přerušení do kodonů našeho zájmového genu.

Produktem genové exprese je tedy hybridní protein, skládající se z krátkých bakteriálních polypeptidů fúzovaných na amino konci našeho cílového polypeptidu se & shyquence. Tento hybridní polypeptidový řetězec sestávající ze dvou různých typů polypeptidů se nazývá fúzní protein.

Následující důvody jsou důvody pro začlenění fúzního proteinu před náš požadovaný gen:

(a) Přítomnost bakteriálního peptidu na začátku fúzního proteinu může stabilizovat molekulu a zabránit jejímu degradaci hostitelskou buňkou. Na rozdíl od toho jsou polypeptidy, které postrádají bakteriální seg­ment, často zničeny.

(b) Bakteriální polypeptid může působit jako signální peptid, zodpovědný za transport našeho cílového proteinu na konkrétní místo, odkud jsou sbírány. Například pokud jsou bakteriální peptidy odvozeny z proteinu, který je buňkou exportován (např. Produkty genů ompA), pak bude náš cílový polypeptid jednoduše transportován mimo hostitelskou buňku přímo do kultivačního média, odkud je lze shromáždit .

(c) Bakteriální polypeptid může také pomoci při čištění cílového polypeptidu různými purifikačními technikami, jako je afinitní chromatografie.

Klasifikace vektoru # 2.

Na základě použité hostitelské buňky:

Po konstrukci rekombinantní DNA mohou být tyto zavedeny do hostitelské buňky. Vektory jsou tedy navrženy a konstruovány tak, že závisí na hostitelské buňce. Všechny části vektorů musí být funkčně kompatibilní s hostitelem. Pokud například vytváříme vektor pro bakteriálního hostitele, musí mít vhodný počátek replikace, který bude funkční v bac & shyteriální buňce.

V závislosti na tomto základě jsou vektory klasifikovány jako:

1. Vektory pro bakterie:

Jedná se o specifický a replikační bakteriální původ replikace a markery odolné vůči & shytibiotické rezistenci. Bac & shyteria podporují různé druhy vektorů, např. plazmidové vektory, bakteriofágové vektory, kosmidy, phasmidy, fagemidy atd.

Mají speciální počátek replikace nazývaný jako autono­mously replikující se sekvence (ARS), např. kvasinkové replikativní plazmidové vektory (YRp) atd.

3. Vektory pro zvířata:

Tyto vektory jsou v biotechnologii potřebné pro syntézu rekombinantního proteinu z genů, které nejsou správně exprimovány při klonování do E. coli nebo kvasinek, a metody klonování u lidí hledají kliničtí mo & shylekulární biologové pokoušející se vymyslet techniky pro genovou terapii, v u kterých je nemoc léčena zavedením klonovaného genu do pacienta, např. P-element, SV40 atd.

Produkce geneticky modifikovaných rostlin se stala možnou díky úspěšnému použití rostlinných vec­torů. např. Ti-plazmid, Ri-plazmid atd.

Klasifikace vektoru # 3.

Na základě buněčné povahy hostitelské buňky:

Na tomto základě jsou vektory dvou typů:

1. Prokaryotické vektory:

To zahrnuje všechny vektory pro bakteriální buňky.

To zahrnuje všechny vektory pro kvasinky, živočišné a rostlinné buňky.

Prokaryotické vektory (bakteriální vektory):

Buňka E. coli, která se často používá jako prokaryotický hostitel, potřebuje specifické typy vec & shytorů, které jsou navrženy tak, aby fungovaly a fungovaly v její cytoplazmě. Vektory na bázi plazmidu a na bakteriofágu jsou nejběžnějšími prokaryotickými vektory.Prokaryotické vektory zahrnují vektory odvozené od plazmidu, vektory odvozené od bakteriofága, vektory od fagemidů, plazmidové vektory a fosmidové vektory.

Ty jsou dis & shycussed následujícím způsobem:

Toto jsou nejběžnější vektory pro prokaryotické hostitelské buňky. Bakterie jsou schopny ex & shypress cizích genů vložených do plazmidů (obr. 4.13). Plazmidy jsou malé, kruhové, dvouvláknové molekuly DNA postrádající proteinový obal, který se přirozeně vyskytuje v cytoplazmě mnoha kmenů bakterií.

Některé z příkladů přirozeně se vyskytujících plazmidů jsou Ti plazmidy, F-faktory, R-faktory, Co/E1 plazmid atd. Plasy a shymidy jsou nezávislé na chromozomu bakteriální buňky a jejich velikost se pohybuje od 1 000 do 200 000 párů bází. Pomocí enzymů a 70s ribozomů, které jsou uloženy v bakteriální buňce, lze replikovat a exprimovat DNA obsaženou v plazmidech.

Bakteriální buňky těží z pre -shysence plazmidů, které často nesou geny, které exprimují proteiny schopné propůjčit rezistenci vůči antibiotikům. Ty také chrání bakterie tím, že nesou a přenášejí geny pro odolnost vůči toxickým těžkým kovům, jako je rtuť, olovo nebo kadmium.

Kromě toho některé bakterie nesou plazmidy s geny, které umožňují bakteriím rozložit její & shybicidy, určité průmyslové chemikálie nebo složky ropy. Vztah mezi bakteriemi a plazmidy je endosymbiotický, jak bakterie, tak plazmidy těží ze vzájemného uspořádání. Plazmidy mají také charakteristický počet kopií.

Čím vyšší je počet kopií, tím vyšší je počet jednotlivých plazmidů v hostitelské bakteriální buňce. Pokud existuje více kopií plazmidu, bude syntetizováno více proteinů kvůli většímu počtu genových kopií nesených plazmidem. Počet a shyber kopií hraje roli ve fenotypové mani & shyfestaci genu. Například čím více policistů a plachých genů pro odolnost vůči antibiotikům existuje, tím vyšší je odolnost vůči antibiotikům.

Je velmi důležité si uvědomit, že přirozeně se vyskytující a stydlivé plazmidy nemají všechny potřebné sekvence, které molekula DNA vyžaduje, aby fungovala jako výnosný vektor. Díky tomu jsou přírodní plazmidy extrahovány a modifikovány vložením vhodných segmentů DNA a je vytvořena kompletní vektorová molekula DNA.

Plasmidové klonovací vektory jsou odvozeny z bakteriálních plas­midů a jsou nejrozšířenějšími, nejuniverzálnějšími a snadno manipulovatelné.

Následují různé typy plazmidových vektorů:

Toto byl první široce používaný, účelově sestavený plazmidový vektor. pBR322 má relativně malou velikost 4 363 bp. To je důležité, protože účinnost transformace je nepřímo úměrná velikosti a nad 10 kbp je velmi nízká.

V pBR322 tedy existuje ‘room ’ pro vložku alespoň šesti kbp. Tento vektor má také rea & shysonably vysoký počet kopií (

15 kopií na buňku), což lze 200krát zvýšit léčbou inhibitorem syntézy proteinů-amplifikací chloramfenikolem.

Názvosloví pBR 322:

Nomenklaturu ‘pBR 322’ lze pochopit s následujícím vysvětlením:

1. ‘p’ označuje jako plazmid

2. ‘BR ’ identifikuje Bo-Liver a Rodriguez, dva výzkumníky, kteří jej vyvinuli

3. � ’ odlišuje tyto plazmidy od ostatních (jako pBR 325, pBR 327 atd.) Vyvinutých ve stejné laboratoři.

Konstrukce pBR322:

1. Počátek replikace:

Je nositelem fragmentu a plazmatu plazmidu pMB1, který funguje jako ori & shygin pro replikaci DNA a zajišťuje tak množení vektoru.

Je nositelem dvou genů rezistence a shybiotiky - ampicilinu a tetracyklinu.

Nese řadu jedinečných restrikčních míst. Některé z nich se nacházejí v jednom z genů rezistence na antibiotika (např. Místa pro Pst I, Pvu I a Sac I se nacházejí v Ampr a BamHI a Hind III v Tetr). Klonování do jednoho z těchto míst inaktivuje gen, který umožňuje odlišit rekomby a shynanty od nerekombinantů známých jako inzerční inaktivace.

Podle rodokmenu rozumíme původu pBR322. pBR322 není přirozeně se vyskytující plazmid. Vyrábí se podle kroků cer & shytain, které jsou uvedeny na (obr. 4.15). Je důležité poznamenat, že pBR322 obsahuje DNA odvozenou ze tří různých přirozeně se vyskytujících plazmidů.

Gen amp R původně přešel na plazmid R1 (přirozeně se vyskytující a shyringový antibiotikum rezistentní plazmid v E. coli), tet R je odvozen od R6-5 (druhý plazmid odolný vůči antibiotikům) a původ replikace a shytion je odvozen od pMB1, který je blízce příbuzný s plazmidem ColE1 produkujícím kolicin.

Rekombinantní selekce s pBR322 – insekční inaktivací genu antibiotické rezistence­tance.

Když jsme do hostitelské buňky zavedli naši rekombinantní DNA (požadovaný vektor + požadovaný gen) (procesem zvaným transformace a hostitelské buňky, které rekombinantní DNA zabírají, se nazývají transformované hostitelské buňky), pak musíme provést screening celé hostitelské populace v za účelem selekce transformovaných buněk (s rekombinantní DNA) od netransformovaných (bez rekombinantní DNA).

Každý vektor má s tímto screeningem spojený nějaký mechanismus.

Zde probereme, jaký je v tomto ohledu mechanismus sledovaný vektorem pBR322. pBR322 má několik unikátních restrikčních míst, která lze použít k otevření vec & shytor před vložením nového fragmentu DNA. BamHl například štěpí pBR322 pouze v jedné poloze v rámci shluku genů, které kódují rezistenci vůči tetracyklinu.

Rekombinantní molekula pBR322, která nese další kus DNA v místě BamHl, již není schopna propůjčit hostiteli rezistenci vůči tetracyklinu, protože jeden z nezbytných genů je nyní odpojen vloženou DNA. Buňky obsahující tuto rekombinantní molekulu pBR322 jsou stále rezistentní na ampicilin, ale citlivé na tetrashycyklin (ampRtefs).

Screening pBR322 re & shycombinantů se provádí následujícím způsobem. Po transformaci jsou buňky umístěny na ampicilinové médium a inkubovány, dokud se neobjeví barvičky [obr. 4.16 (a)].

Všechny tyto kolonie jsou transformanty (pamatujte, že netransformované buňky jsou amp s, a tak nevytvářejí kolonie na selektivním médiu), ale pouze několik obsahuje a rekombinantní molekuly pBR322: většina obsahuje normální, samoligovaný plazmid. K identifikaci a shytifikaci rekombinantů se kolonie replikují na agarové médium, které obsahuje tetra & shycyklin [obr. 4,16(b)].

Po inkubaci některé z původních kolonií znovu rostou, ale jiné ne [obr. 4,16(c)]. Ty, které rostou, se skládají z buněk, které nesou normální pBR322 bez vložené DNA, a tedy z funkčního klastru genové rezistence vůči tet & shyracyklinům (amp R tet R).

Kolonie, které nerostou na tetracyklinovém agaru, jsou rekombinanty (amp R tef s), jakmile jsou známy jejich polohy, vzorky pro další studium lze získat z původní misky s ampicilinovým agarem.

Je široce používán jako klonovací vektor. Kromě toho je široce používán jako modelový systém pro studium prokaryotické transkripce a translace.

Výhody pBR322:

4,4 kb) umožňuje snadné čištění a manipulaci.

2. Dva volitelné markery (amp a tet) umožňují snadnou selekci rekombinantní DNA.

3. Když je syntéza bílkovin blokována aplikací chloramfenikolu, lze ji zesílit až na 1 000–3 000 kopií na buňku.

Nevýhody pBR322:

1. Má velmi vysokou pohyblivost i. e se může přesunout do jiné buňky v přítomnosti konjugativního plazmidu podobného F-faktoru. Za tuto funkci je zodpovědná oblast nic-bom (bom = základ mobility) pBR322. V důsledku toho se může vektor ztratit v populaci smíšených hostitelských buněk.

2. Existuje omezení ve velikosti požadovaného genu, který může pojmout.

3. Není přítomen příliš vysoký počet kopií, jak se od dobrého vektoru očekává.

4. Ačkoli inzerční inaktivace genu rezistence na antibiotika poskytuje účinný a efektivní způsob rekombinantní identifikace a shytion, způsob je nepohodlný z důvodu nutnosti provést dva screeningy, jeden s antibiotikem, které vybírá trans-formanty, a poté druhý screening po replikační pokovování s & shytibiotikem, které rozlišuje rekombinanty.

Díky tomu je screeningový proces časově náročný a pracný.

Další vektor pBR327 byl odvozen z pBR322 delecí nukleotidů mezi 1427 až 2516. Tyto nukleotidy jsou deletovány, aby se zmenšila velikost vektoru a aby se odstranily sekvence, o kterých je známo, že interferují s expresí klonované DNA v eukaryotických buňkách. pBR327 stále obsahuje geny pro odolnost a odolnost vůči dvěma antibiotikům (tetracyklin a ampicilin).

pBR327 má oproti pBR322 následující dvě výhody & výhody:

1. pBR327 má vysoký počet kopií (30-45 copů a plachých na buňku).

pUC se získají úpravou vektoru pBR322. pUC vektory jsou menší než pBR322, protože jsou pouze

2,7 kb. Ale relativně mají vysoký počet kopií. Mutace v počátku replikace produkuje 500 až 600 kopií plazmidu na buňku bez amplifikace.

Názvosloví vektorů pUC:

Názvosloví ‘pUC ’ lze pochopit s následujícím vysvětlením:

1. ‘p’ označuje plazmid.

2. ‘UC ’ znamená Kalifornská univerzita, kde byla poprvé vyvinuta J. Mess & shying et al.

Potom také vidíme mnoho čísel jako pUC8, pUC18, pUC19 a tak dále. Jsou to jen série pUC a byly pojmenovány jen tak, aby se od sebe navzájem oddělily.

Konstrukce vektorů pUC:

1. Počátek replikace: Je odvozen od počátku replikace pBR322. Původ ColE1 replikace pBR322 byl modifikován provedením náhodné mutace tak, aby každá transformovaná buňka E. coli měla 500-600 kopií plazmidu.

2. Volitelný marker: Má gen odolný vůči ampicilu a shylinu. Transformované hostitelské buňky mohou růst na médiu s ampicilinem, zatímco netransformované buňky hynou.

3. lac Z ’ gen s MCS.

4. Do tohoto vektorového kódu je začleněn lac Z ’ pro enzym beta-galaktosidázu, který působí na chromogenní substrát zvaný X-gal (přítomný v bakteriálním kultivačním médiu). Exprese lac z ’ genu je in & shyduced jinou sloučeninou přítomnou ve stejném médiu zvaném iso-propyl-thiogalactoside (IPTG).

Když proběhne reakce enzymového substrátu, pak se X-gal přemění z bílé na modrou sloučeninu. Nyní samotný gen lac Z ’ má MCS. Když byl tedy požadovaný gen zaveden do genu lac Z’, pak selže kódovat beta-galaktosidázu, a tak v tomto případě substrát (X-gal) není nikdy převeden na žádnou jinou barvu. Tento typ screeningu se nazývá modrobílá obrazovka a shying.

Rodokmen pUC vektorů:

Během konstrukce pUC je jediným se & shylectable markerem, který je držen mimo pBR322, gen rezistentní na ampicilin. Ale všechny MCS jsou odstraněny z zesilovače R provedením náhodných mutací. Počátek replikace ColE1 je také modifikován stejným procesem, takže může plynule provádět proces replikace a shytion znovu a znovu nakonec zvýšit počet kopií vektoru.

Spolu s tím je také vložena lac Z ’ sekvence kódující beta galaktosidázu. Obdobně po tomto pokusem o náhodnou mutaci vytvoříme MCS v sekvenci lac Z’ (obr. 4.19).

Screening transformovaných hostitelských buněk us­ing pUC vektorů:

Po transformaci hostitelských buněk provedeme jejich screening, abychom vybrali transformované buňky z netransformovaných. pUC8 [obr. 4.20 (a)], který nese gen rezistence na ampicilin a gen nazývaný lac Z ’, který kóduje část enzymu beta-galaktosidázy.

Klonování s pUC8 zahrnuje inzerční inaktivaci genu lac Z ’, přičemž rekombinanty byly identifikovány kvůli jejich neschopnosti syntetizovat beta-galaktosidázu [obr. 4,20 písm. B)].

Beta-galaktosidáza je jedním ze série enzymů, které se podílejí na rozkladu laktózy na glukózu a galaktózu. Normálně je kódován genem lac Z, který sídlí na chromozomu E. coli. Některé kmeny E. coli mají modi & shyfied lac Z gen, který postrádá segment re & shyferred jako lac Z ’ a kódující a-peptidovou část beta-galaktosidázy [Obr. 4.21(a)].

Tyto mutanty mohou syntetizovat enzym pouze tehdy, když obsahují plazmid, jako je pUC8, který nese chybějící lac Z’ segment genu.

Klonovací experiment s pUC8 zahrnuje selekci trans-formantů na ampicilinovém agaru s následným screeningem na aktivitu beta-galaktosidázy za účelem identifikace rekombinantů. Buňky, které obsahují normální plazmid pUC, jsou ampR a jsou schopné syntetizovat beta-galaktosidázu [Obr. 4,21 (a)] rekombinanty jsou také ampR, ale nestydí se vytvářet beta-galaktosidázu [obr. 4,21 písm. B)].

Screening na přítomnost nebo nepřítomnost beta-galaktosidázy je ve skutečnosti docela snadný. Spíše než test na štěpení laktózy na glukózu a galaktózu testujeme mírně odlišnou reakci a shytion, která je také katalyzována beta-galaktosi a shydázou.

To zahrnuje analog laktózy zvaný X-gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galaktopyranosid), který je štěpen beta-galaktosidázou na produkt, který je zbarven tmavě modře.

Pokud se k agaru přidá X-gal (plus induktor en & shyzymu, jako je iso-pro-pylthiogalaktosid, IPTG), spolu s ampicilinem, pak budou nerekombinantní kolonie, jejichž buňky syntetizují beta-galaktosidázu, zbarveny modře vzhledem k tomu, že rekombinanty s narušeným genem lac Z ’ a neschopné vytvořit p-galaktosidázu, budou bílé.

Tento systém, který se nazývá Lac výběr, je shrnut na [Obr. 4,21(b)]. Všimněte si, že jak rezistence na ampicilin, tak přítomnost nebo absence p-galaktosidázy je testována na jedné agarové plotně. Tyto dva screeningy a shyings se proto provádějí společně a není potřeba časově náročný krok pokovování replikou, který je nezbytný u plas & shymidů, jako je pBR322.

Použití vektorů pUC:

pUC vektory mohou být použity jak jako klonovací vec & shytor, tak jako expresní vektor. Při použití jako expresní vektor jsou jeho sekvence mírně upraveny tak, aby splňovaly nezbytné požadavky.

Výhody vektorů pUC:

Vektory pUC nabízejí oproti vektorům pBR322 následující hlavní výhody:

(a) Vysoký počet kopií 500-600 kopií na buňku.

(b) Snadný a jednokrokový výběr.

(c) Jedinečná restrikční místa použitá pro klonování jsou seskupena v MCS. To umožňuje klonování fragmentu DNA se dvěma různými lepivými konci.

Nevýhody pUC:

Nemůže pojmout požadovaný gen větší než 15 kb.

Ty jsou podobné kosmidům, ale jsou založeny na bakteriálním F-plazmidu. Klonovací vektor je omezený, protože hostitel (obvykle E. coli) může obsahovat pouze jednu molekulu fosmidu. Fosmidy jsou 40 kb náhodné genomové DNA. Fosmidová knihovna je připravena z genomu cílového organismu a klonována do fosmidového vektoru.

Nízký počet kopií nabízí vyšší stabilitu než srovnatelné kosmidy s vysokým počtem kopií. Fosmidový systém může být užitečný pro konstrukci stabilních knihoven ze složitých genomů.

Vektory odvozené od bakteriofágů:

Bakteriofágy nebo fágy, jak jsou běžně známé, jsou viry, které specificky obsahují & shyfektují bakterie. Jako všechny viry mají fágy velmi jednoduchou strukturu, skládají se pouze z molekuly DNA (nebo občas ribonukleové kyseliny (RNA)) nesoucí řadu genů, včetně několika genů pro replikaci fága, obklopené ochranným obalem nebo kapsidou tvořenou proteinem. molekuly (obr. 4.22).

Obecný vzor infekce, který je stejný pro všechny typy fágů, je třístupňový proces:

1. Fágová částice se přichytí na vnější stranu bakterie a vstříkne její DNA chromo & shysome do buňky.

2. Molekula fágové DNA se replikuje, obvykle specifickými fágovými enzymy kódovanými geny na fágovém chromozomu.

3. Další fágové geny řídí syntézu pro­teinových složek kapsidy a nové fágové částice se sestavují a uvolňují z bakterie.

U některých typů fágů je celý infekční cyklus dokončen velmi rychle, možná za méně než 20 minut. Tento typ rychlé infekce se nazývá lytický cyklus, protože uvolňování nových částic ph­age je spojeno s lýzou bakteriální buňky.

Charakteristickým rysem cyklu lytické infekce je, že po replikaci a shykaci fágové DNA bezprostředně následuje syntéza kapsidových proteinů a molekula fágové DNA není v hostitelské buňce nikdy udržována ve stabilním stavu. Na rozdíl od lytického cyklu je lysogenní infekce charakterizována retencí molekuly fágové DNA v hostitelské bakterii, pravděpodobně pro mnoho tisíc buněčných dělení.

Fred Blatter a jeho kolegové byli první, kdo vyvinul bakteriofág jako vektor.

Následují různé typy plazmidových vektorů:

I. Bakteriofágové M13 vektory:

Rodina vektorů M13 je odvozena z bac & shyteriophage M13. Jedná se o samce specifický (infikuje E. coli s f. pili), lysogenní filamentózní fág s cirkulárním jednovláknovým DNA genomem o délce asi 6 407 bp (6,4 kb). Jakmile se dostane do hostitelské buňky, jednovláknová DNA fága M13 funguje jako templát pro syntézu a shysis komplementárního vlákna, což vede k normální dvouvláknové DNA [obr. 4,23(a)].

Tato molekula není vložena do genomu bacte & shyrial, ale místo toho se replikuje, dokud není v buňce přítomno více než 100 kopií [obr. 4,23 (b)]. Když se bakterie dělí, každá dceřiná buňka obdrží kopie fágového genomu, který pokračuje v replikaci, čímž si zachovává svůj celkový počet na buňku.

Jak je znázorněno na [obr. 4.23 (c)], nové částice fága jsou kontinuálně sestavovány a uvolňovány, přičemž během každé generace infikované buňky je produkováno přibližně 1000 nových ph & shyage.

Přitažlivost M13 jako klonovacího vektoru:

Několik funkcí M13 činí tento fág at & shytractive jako základ pro klonovací vektor. Genom je menší než 10 kb, což je dobře v rozsahu požadovaném pro potenciální vektor. Kromě toho se dvouřetězcová replikativní forma (RF) genomu M13 chová velmi podobně jako plazmid a může být jako taková zpracována pro experimentální účely.

Snadno se připravuje z kultury infikovaných buněk E. coli a lze jej znovu zavést transfekcí. Nejdůležitější je, že geny klonované vec & shytor na bázi M13 lze získat ve formě jednovláknové DNA. Jednořetězcové verze klonovaných genů jsou užitečné pro několik technik, zejména pro sekvenování DNA a in vitro mutagen­esis.

Použití vektoru M13 je snadný a spolehlivý a stydlivý způsob získání jednovláknové DNA pro tento typ práce.

Konstrukce vektorů M13:

Prvním krokem při konstrukci vektoru M13 klon­ing je zavedení genu lac Z’ do intergenové sekvence. To vede k vzniku M13 mp1, který tvoří modré plaky na X-gal agaru (obr. 4.25 (a)) M13 mp1 neprogreduje žádné restrikční místo jednotky v genu lac Z ’.

Obsahuje však hexanukleotidovou sekvenci GGATTC blízko začátku genu. Jediná změna nukleotidu (použitím in vitro mutagen­esis) by vytvořila tento GAATTC, což je místo EcoR1.

To má za následek vznik M13 mp2.M13 mp2 má mírně pozměněný gen lac Z’, ale enzym beta-galaktosidáza produkovaný buňkami infikovanými M13 mp2 je stále dokonale funkční. M13 mp2 je nejjednodušší vektor M13. Fragmenty DNA s lepivými konci ECoR1 mohou být vloženy do klonovacího místa a rekombinanty jsou rozlišeny jako čiré plaky na X-gal agaru.

Jdeme na další úpravy M13 mp2, což vede k výrobě dalšího vektoru M13 nazvaného M13 mp7. Při generování M13 mp7 nejprve syntetizujeme krátký oli & shygonukleotid nazývaný poly-linker, který se skládá ze série restrikčních míst a má lepivé konce EcoR1. Tento polylinker je vložen do místa EcoRI M13 mp2, aby se vytvořil M13mp7.

Tento polylinker také poskytuje až čtyři možná klonovací místa (ECoRI, BamHI, Sail a PstI) do nového vektoru. Je velmi důležité poznamenat, že poly-linker je navržen tak, aby zcela nenarušil gen lac Z ’: v poly-linkeru je udržován rámec pro čtení a stínování a funkční, i když změněný enzym beta-galaktosidázy je stále vyrábí.

Screening transformovaných hostitelských buněk pomocí nás a blokování vektorů bakteriofága M13:

Vložení nové DNA téměř vždy předchází a brání produkci beta-galaktosidázy. Rekombinantní plaky jsou na X-gal agaru čiré. Pokud se poly-linker znovu vloží a původní M13mp7 se reformuje, změní se a vytvoří se modré plaky.

Použití vektorů bakteriofága M13:

Po dlouhou dobu byla nejdůležitější aplikace M13 clon & shying při určování sekvence DNA Sangerovou metodou, také nazývanou dideoxy nebo metoda ukončení řetězce. To závisí na syntéze DNA v přítomnosti inhibitorů ukončujících řetězec, 2 ′, 3 ′-di-deoxynukleosid trifosfátů (ddNTPs). Tato metoda je nyní velmi standardním nástrojem molekulární biologie.

2. Fágové zobrazovací vektory:

Důležité použití vláknitých fágů je v systémech phage dis & shyplay. Zde jsou kódující sekvence vloženy do jednoho z genů obalového proteinu. Výsledkem je, že fág je generován s hybridní formou tohoto proteinu, která je fúzí normální proteinové sekvence a proteinového produktu vložené se­quence (za předpokladu, že vložená sekvence má stejný čtecí rámec jako gen pro obalový protein).

Fágy jsou vylučovány z buňky a tento extra materiál je ‘zobrazen’ na vnější straně. Tyto zobrazovací vektory mají mnoho použití, např. Při screeningu knihoven posouváním a pro produkci vakcín.

Některé protokoly pro místně cílenou mutagenezi také používají jednovláknovou DNA, kterou lze získat vektory založenými na vláknitých fágech. Jednovláknová DNA se také zvláště používá při generování sond pro analýzu a shysis RNA.

Mohou být připraveny sondy, které jsou specifické pro transkripty RNA z obou řetězců DNA. Poslední jmenované aplikace jsou mimo rozsah této knihy, ale více informací a shymation lze získat ze specializovaných laboratorních příruček.

Výhody vektoru bakteriofága M13:

1. Výhody oproti Lambda Phage Vec­tor:

M13 je příkladem vláknitého fága a je ve struktuře a shyture zcela odlišný od lambda. Molekula DNA M13 je navíc mnohem menší než genom lambda a má pouze 6407 jader a shyotidů. Je kruhový a je neobvyklý v tom, že se skládá výhradně z jednovláknové DNA.

Menší velikost molekuly DNA M13 znamená, že má místo pro méně genů než genom lambda. To je možné, protože kapsid M13 je vytvořen z několika kopií pouhých tří proteinů (vyžadujících pouze tři geny), zatímco syntéza struktury hlavy a ocasu lambda zahrnuje více než 15 odlišných a stylových proteinů.

Navíc M13 sleduje jednodušší infekční cyklus než lambda a nepotřebuje geny pro inzerci do hostitelského genomu. K injekci molekuly DNA M13 do buňky E. coli dochází prostřednictvím pilusu, struktury, která spojuje dvě buňky během sexuální konjugace.

Vektory založené na M13 spočívají v tom, že obsahují stejné polylinkerové a alfa-peptidové fragmenty jako série pUC a rekombinanty mohou být vybrány testem modré → bílé barvy. Také velikost genomu je menší než 10 kb, a tak se s ním snadno manipuluje.

Nevýhody bakteriofága M13 vec & shytors:

Níže jsou uvedeny nevýhody vektorů bacte & shyriophage M13:

1. Zajímavý gen větší než 2 kB nelze klonovat.

2. Má nízký výtěžek DNA.

3. Fág produkuje mnoho toxinů ve vysoké koncentraci.

II. Lamda Phage Vectors:

Toto je široce používaný vektor pro klonování velmi velkých částí genů.

Lambda je typickým příkladem fága hlava a ocas. Genetickým materiálem je DNA, která je přítomna ve struktuře polyedrické hlavy, a ocas slouží k přichycení fága k povrchu bakterií a k injektování DNA do buňky. Molekula lambda DNA má velikost 49 kb.

Je to mírná fáze a může provádět lytické a lyzogenní cykly. Pozice a identity většiny genů na molekule DNA lambda jsou známy (obr. 4.28).

Lambda fág může mít lineární i kruhovou formu DNA. Molekula zobrazená na (obr. 4.28) je lineární, má dva volné konce a představuje DNA přítomnou v hlavě fága. Tato lineární molekula se skládá ze dvou vzájemně se doplňujících řetězců DNA, párovaných bází podle Watson-Crickových pravidel. Na každém konci molekuly je však krátký 12-nukleotidový úsek, ve kterém je DNA jednořetězcová [obr. 4,30 písm. A)].

Dvě jednotlivá vlákna jsou komplementární, a tak se mohou navzájem párovat báze za vzniku kruhové, zcela dvouvláknové molekuly [obr. 4,30 (b)]. Komplementární­mentární jednotlivé řetězce jsou často označovány jako ‘sticky’ konce nebo kohezivní konce, protože párování bází mezi nimi může ‘slepit’ dohromady dva konce molekuly DNA (nebo konce dvou různých molekul DNA).

Lambda soudržné konce se nazývají místa cos a během cyklu lambda in & shyfection hrají dvě odlišné role. Za prvé umožňují cirkulaci lineární molekuly DNA, která je injikována do buňky, cirkulaci, což je nezbytným předpokladem pro vložení do bakteriálního genomu (obr. 4.29).

Druhá role míst cos je poněkud odlišná a vstupuje do hry poté, co se pro-ph & shyage vyřízne z hostitelského genomu. V této fázi je mechanismem replikace s kruhovým kruhem produkován velký počet nových molekul DNA lambda [obr. 4.30 (c)], ve kterém se z molekuly templátu odvaluje souvislé vlákno DNA. Výsledkem je katenan skládající se z řady lineárních genomů A spojených dohromady v kosmických lokalitách.

Úlohou cos míst je nyní působit jako rozpoznávací sekvence pro endonukleázu, která štěpí catenan v cos místech, produkující jednotlivé lambda genomy. Tato endonukleáza, která je produktem genu A na lambda DNA mol & shyecule, vytváří jednovláknové lepkavé konce a také působí ve spojení s jinými proteiny, aby zabalila každý genom lambda do struktury fágové hlavy.

Procesy štěpení a balení rozpoznávají pouze místa cos a sekvence DNA na obou jejich stranách. Změna a vyhnutí se struktuře vnitřních oblastí genomu lambda, například vložením nových genů, nemá na tyto události žádný vliv, pokud není celková délka genomu A příliš výrazně změněna.

Problémy spojené s přirozeně se vyskytujícím a lambda fágem, který se používá jako klonové a shying vektory:

Před vytvořením klonovacích vektorů založených na lambda je třeba vyřešit dva problémy:

1. Molekula lambda může být zvětšena pouze o 5 %, což představuje ad­dici pouze 3 kb nové DNA. Pokud je celková velikost molekuly větší než 52 kB, pak ji nelze zabalit do struktury hlavy lambda a netvoří se infekční fágové části. To výrazně omezuje velikost fragmentu DNA, který může být vložen do nemodifikovaného lambda vec­toru.

2. Genom lambda je tak velký, že má více než jednu rozpoznávací sekvenci prakticky pro každou restrikční endonukleázu. Omezení nelze použít k odštěpení normální molekuly lambda způsobem, který umožní vložení nové DNA, protože molekuly by byly rozřezány na několik malých fragmentů, u nichž by bylo velmi nepravděpodobné, že by reformovaly životaschopný genom lambda na relega & shytion.

Z těchto důvodů nemůže být DNA přirozeně se vyskytujícího fágu lambda použita jako klonovací vektor. Abychom tento problém vyřešili, upravili jsme genom lambda’s a upravili jej tak, aby byl úspěšným vektorem.

Řešení problémy:

Z výzkumu bylo zjištěno, že velký segment v centrální oblasti molekuly DNA lambda lze odstranit, aniž by byla ovlivněna schopnost fága infikovat buňky E. coli. Odstranění této nestydaté oblasti mezi pozicemi 20 a 35 na mapě zmenšuje velikost genomu lambda až o 15 kB.

To vytváří prostor až pro 18kb nové DNA, kterou lze do ní přidat za vzniku rekombinantní molekuly.

Takto odstraněné neesenciální geny se podílejí na integraci a excizi lambda pro-fága z chromozomu E. coli. Odstraněný lambda genom je tedy nelyzogenní a může sledovat pouze cyklus lytické infese a shytion. To je samo o sobě žádoucí pro klon & shying vektor, protože to znamená, že můžeme získat plaky (viditelná struktura vytvořená v buněčné kulise a shyture, jako jsou bakteriální kultury v nějakém živném médiu).

Můžeme odstranit nepotřebná restrikční místa provedením mutageneze in vitro. Místo ECoRI, GAATTC, lze například změnit na GGATTC, které enzym nerozpozná.

Druhy lambda vektorů:

Existují dva typy lambda klonovacích vektorů.

(a) Lambda inzerční vektory:

V tomto případě byl odstraněn velký segment neesenciálního re & shygionu a obě ramena byla spojena dohromady. Inzerční vektor obsahuje alespoň jedno unikátní restrikční místo, do kterého může být vložena nová DNA. Velikost fragmentu DNA, který může jednotlivý vektor nést, závisí na rozsahu, ve kterém byla odstraněna neesenciální oblast, např. lambda-gtl0, lambda- ZAP11.

(b) Náhradní vektory lambda:

Tyto vektory mají dvě rozpoznávací místa pro restrikční endonukleázy. Tato místa lemují segment DNA, který je nahrazen DNA, která má být klonována [Obr.4.34(a)]. Vyměnitelný fragment (nebo stufferový fragment) nese další restrikční místa, která lze použít k rozřezání na malé kousky, takže jeho vlastní opětovné vložení během klonovacího experimentu je velmi nepravděpodobné.

Re­placement vektory jsou obecně navrženy tak, aby nesly velké kusy DNA, než které mohou zpracovat inser­tion vektory, např. lambda-EMBL, lambda-GEMll atd.

Klonovací experimenty s lambda inserty a shytion nebo náhradními vektory:

Klonovací experiment s lambda vektorem lze provést podobným způsobem, jakým jsme postupovali u plazmidového vektoru - molekuly lambda DNA se rozštěpí vhodným a stydlivým restrikčním endonukleázovým enzymem, přidá se požadovaný gen, směs se liguje a výsledná rekombinantní DNA je zavedena do hostitelské buňky E. coli (procesem nazývaným trans & shyfection) [obr. 4,35 písm. A)].

Tento typ experimentu vyžaduje, aby vektor byl ve své kruhové formě, s cos místy vodíkovými vazbami k sobě navzájem.

Transfekční proces, který vyžaduje kruhovou molekulu DNA lambda, není zvláště účinný a shylarně účinný. Abychom získali větší počet rekombinantů, můžeme do genomu lambda zavést určité zdokonalení a styky. V tomto ohledu můžeme preferovat lineární formu vektoru. Když je lineární forma vektoru štěpena příslušnou restrikční endonukleázou, levé a pravé rameno se uvolní jako oddělené fragmenty a fragmenty.

Rekombinantní DNA může být konstruována smícháním našeho požadovaného genu s vektorovými rameny [obr. 4,35 (b)]. Ligace má za následek několik molekulárních uspořádání, včetně katenových řetězců obsahujících levé rameno-DNA-pravé rameno mnohokrát opakovaných. Rekombinantní ph­age takto produkované ve zkumavce lze použít k infekci kultury E.coli.

Vizualizace fágové infekce po procesu transfekce:

Po vstupu rekombinantní DNA do hostitelské buňky následuje lytický cyklus, který nakonec vede k lýze hostitelské buňky. Lyzovaná hostitelská buňka může být umístěna na agarovém médiu jako plaky na trávníku bakterií. Každý plak je zóna čištění, která vzniká tím, že fágy lyzují buňku a pokračují v infekci sousedních bakterií.

Screening transformovaných hostitelských buněk nás a blokování vektorů lambda bakteriofága:

K rozlišení a zastrašování rekombinantních plaků od nerekombinantních lze použít různé způsoby.

Metody jsou následující:

(a) Inzerční inaktivace genu Lac Z’ neseného fágovým vektorem lambda:

Inzerce našeho požadovaného genu do genu lac Z’ inaktivuje syntézu beta-galaktosidázy. Rekombinanty se odlišují nanesením buněk na X-gal agar, kde jsou rekombinantní plaky čiré, zatímco nerekombinantní plaky mají modrou barvu.

(b) Inertní inaktivace genu Lambda Cl:

Několik lambda klonovacích vektorů má restrikční místo v genu cl. Inzerční inaktivace genu cl způsobuje viditelnou změnu morfologie plaku. Normální plaky se jeví zakalené (zamlžené), zatímco re­combinant plaky s narušeným genem cl jsou čiré.

(C) Výběr pomocí Spi fenotypu:

P2 ph­age je příbuzný fágu lambda, fágy lamda nemohou infikovat buňky E. coli, které již mají ve svém genomu integrovaný fág P2. Díky tomu je fág lamda považován za Spi- + (citlivý na P2 pro-fág in­fection). Některé klonovací vektory lambda jsou navrženy tak, aby inzerce nové DNA způsobila změnu ze Spi-+ na Spi-–, což umožnilo rekombinantu infikovat buňky, které nesou P2 profágy.

Tyto buňky se používají jako hostitel pro klonovací experimenty s těmito vektory. V tomto případě jsou rekombinanty Spi, takže jsou schopné tvořit plaky.

d) Výběr na základě velikosti Lambda Ge­nome:

Od začátku to víme, že jakýkoli požadovaný gen, který je menší než 37 kb nebo větší než 52 kb, nemůže být zabalen do hlavy fága lambda. Mnoho lambda vektorů bylo zkonstruováno odstraněním velkých segmentů molekuly DNA lambda, a jsou tedy kratší než 37 kB.

Ty mohou být zabaleny do zralých fágových částic až poté, co byl vložen náš požadovaný gen. To zvyšuje celkovou velikost genomu až na 37 kb nebo více. Proto se s těmito vektory mohou replikovat pouze rekombi a shynantní fágy.

Použití vektory lambda bakteriofága:

Hlavním využitím všech vektorů na bázi lambda je klonování fragmentů DNA, které jsou příliš dlouhé na to, aby s nimi mohly manipulovat vektory plazmidu nebo M13. Náhradní a plachý vektor, jako je lambda-EMBL4, může nést až 20 kB našeho požadovaného genu. Tento com & shypares s maximální velikostí inzertu asi 8 kb pro téměř všechny plazmidy a méně než 3 kb pro vektory M13.

Výhody Bacteriophage Lambda Vec & shytors

Níže jsou uvedeny výhody lambda vec­tors:

1. Skladování částic fága je srovnatelně mnohem jednodušší než u vektorů na bázi plazmidu.

2. Doba použitelnosti částic fága je nekonečná.

3. Transfekce E. coli je s částicemi fága mnohem snazší.

Nevýhody vektorů lambda bakteriofága:

Pokud jste izolovali klon, je často velmi obtížné izolovat velké množství DNA. V praxi se vyskytuje mnoho problémů, které se u plazmidů nevyskytují. Stále neexistuje žádný skutečně rychlý a spolehlivý protokol pro produkci velmi čisté lambda-DNA.

Nejúspěšnější metodou je použití aniontových výměnných kolon. Nejčastějším problémem je, že přípravek obsahuje nečistoty, které znesnadňují nebo znemožňují další zpracování, jako je restrikční a stydlivé trávení.

I v náhradních vektorech jsou téměř dvě třetiny DNA tvořeny vektorovými sekvencemi. Pokud je to možné, měli byste klonovat sekce, které jsou předmětem zájmu, pomocí plazmidů. Banky LambdaZAP mohou ušetřit práci, protože části plazmidu jsou vyříznuty in vivo spolu s vloženou DNA. Tento proces je vysoce účinný, vyžaduje pouze relativně málo pracovních kroků a trvá pouze 1 až 2 dny.

Jedná se o nejpropracovanější typ vektoru založeného na lambda. Kosmidy jsou hybridy mezi molekulou fágové DNA a bakteriálním plas & shymidem. Jejich návrh se soustředí na skutečnost, že enzymy, které balí lambda DNA mol & shyecule do obalu fágového proteinu, ke svému fungování potřebují pouze místa cos.

Konstrukce kosmidových vektorů:

Kosmid je v podstatě plazmid, který nese místo cos. Také potřebuje selektovatelný marker, jako je gen odolný vůči ampicilinu, a replikační počátek plazmidu. To je důležité poznamenat, že jelikož kosmid postrádá všechny geny lambda, tak at neprodukuje plaky. Místo toho se na selektivním médiu vytvářejí kolonie stejně jako u plazmidových vektorů.

Klonovací experiment s kosmidovými vektory:

To se provádí následovně. Kosmid se otevře a vloží se jeho jedinečné restrikční místo a náš požadovaný gen. Tyto fragmenty jsou obvykle produkovány částečným štěpením restrikční endonukleázou, protože celkové štěpení téměř vždy vede k fragmentům, které jsou příliš malé na to, aby mohly být klonovány kosmidem.

Ligace se provádí tak, aby se vytvořily katenany. Tyto lambda fágy se pak použijí k infekci kultury E. coli. Všechny kolonie jsou rekombinantní kolonie, protože nerekombinantní lambda fágy nelze balit do hlavy lambda bakteriofága.

Použití kosmidových vektorů:

Kosmidy se používají pro konstrukci genomových knihoven eukaryot, protože je lze použít pro klonování velkých fragmentů DNA.

Výhody Cosmidů:

Následují výhody kosmidových vektorů:

1. Tyto mohou být použity ke klonování genu inter & shyest až do 40 kb.

2. Protože lambda fág vloží rekombinantní a shybinantní DNA do hostitelské buňky, další krok vložení rekombinantní DNA do hostitelské buňky se neprovede.

3. Je nalezena snadná metoda screeningu.

Ačkoli jsou vektory M13 velmi užitečné pro produkci jednořetězcových verzí klonovaných genů, mají jednu nevýhodu. Velikost fragmentu DNA, který lze klonovat vektorem M13, je omezen, přičemž 1500 bp je obecně považováno za kapacitu maxi & shymum.

K vyřešení tohoto problému byla zkonstruována řada nových vektorů, kterými jsou hybridy plazmidů a vektorů M13. Říkáme jim fagemidy (‘phage ’ z bakteriofága M13 a ‘mid ’ z plazmidu).

Výstavba Phagemid Vector:

Typický fagemid má následující části:

1. Počátek replikace fága M13.

2. Část genu lac Z ’ poháněná lac pro & shymoter.

3. Vícenásobné klonovací místo (MCS) s lac Z ’ genem.

4. Sekvence promotoru fága T7 a T3 lemující sekvence MCS.

5. Počátek replikace ColE1.

Plazmidy, které nesou počátek replikace M13 navíc ke konvenčnímu počátku syntézy dsDNA, mohou být replikovány buď jako dsDNA z posledně uvedeného nebo jako jednovláknová DNA z počátku M13.Replikace z počátku M13 vyžaduje, aby příslušné pro & shyteiny (jako je protein genu II) byly poskytnuty z pomocného fága, který se také replikuje v buňce.

Replikace generuje jednovláknovou DNA, která pak může být zabalena do fágových plášťů. Příklady fagemidů jsou vektory pUC118, 119 a 120.

Jsou replikovány jako plazmidy, dokud buňka, která je obsahuje, je současně infikována pomocným fágem, jako je M13K07, který poskytuje proteiny pro syntézu a balení jednovláknové DNA. M13K07 je fág M13, který byl modifikován, nejvíce důležitým začleněním počátku replikace plazmidu.

Replikace z tohoto původu umožňuje, aby byl pomocný fág přítomen ve vysokém počtu kopií na buňku, a proto pro & shyvide větší množství proteinů, které jsou potřebné k replikaci a zabalení molekuly fagemidu.

M13K07 také obsahuje gen rezistence na kanamycin, který umožňuje selekci přítomnosti pomocného fága. (Samozřejmě je možné, že může být zabalen také pomocný fág M13K07, ale v praxi se zjistilo, že zabalené molekuly fagemidu jsou ve 100násobném přebytku nad pomocným fágem.)

Dalším příkladem těchto vektorů je řada pBluescript, jako je pBluescriptIIKSÞ, znázorněná na obr. 4.39. Tato řada plazmidů obsahuje, kromě již popsaných znaků, promotory z bakteriofágů E. coli T3 nebo T7, které jsou užitečné pro expresi klonovaných sekvencí.

Použití vektorů Phagemid:

Tento vektor je víceúčelový, protože může sloužit následovně:

Výhody fagemidových vektorů:

Hlavní výhodou systému phagemid je, že jej lze použít k zajištění jedno- nebo dvouvláknového materiálu bez jakéhokoli opětovného klonování.

Phasmids jsou skutečně plazmidy s fágovými geny. Jedná se o lineární duplexní DNA, jejichž konce jsou lambda segmenty, které obsahují všechny geny potřebné pro lytickou infekci a jejichž střední část je linearizována. Jak lambda, tak funkce replikace plazmidu jsou neporušené.

Plazmidové vektory nenesou ani lambda místo připojení a shymentu. Jakmile se dostanou do buňky E. coli, mohou se phas & shymid replikovat jako fág a normálním způsobem vytvářet plaky. Pokud však vektor obsahuje gen, který kóduje lambda represor, pak se plazmid replikuje spíše jako plazmid než jako fág.

V závislosti na fungování nebo nefungování cl-proteinu (kódovaného represorem) se phasmid může replikovat jako plazmid (cl-protein neaktivní) nebo fág, když je aktivní cl-protein. Aktivita cl-proteinu může být neaktivní pěstováním kultury E.coli při 40 ° C.

Plazmidy mohou být použity různými způsoby. Například DNA může být klonována v plazmidovém vektoru běžným způsobem a poté může být rekombinantní plazmid nanesen na fág. Plazmidy se snadno skladují, mají efektivně neomezenou dobu použitelnosti a screening fágů molekulární hybridizací a shytion poskytuje čistší výsledky než screening bac a shyteriálních kolonií.

Většina klonovacích experimentů se provádí s E. coli jako hostitelem a pro tento organismus je dostupná nejširší paleta klonovacích vektorů. E. coli je obzvláště populární, když je cílem klonovacího experimentu studovat základní rysy molekulární biologie, jako je struktura a funkce genu. Za určitých okolností však může být žádoucí použít odlišného hostitele pro experiment klonování genu.

Ale když cílem experimentu RDT není jen studium genu, ale použití klonování ke kontrole nebo zlepšení syntézy důležitého metashybolického produktu (např. hormonu jako je insu­lin) nebo ke změně vlastností orgánu a stydlivosti (např. k zavedení odolnosti vůči herbicidům do plodiny), potom vezmeme hostitelskou buňku, která je pokročilejší a schopná splnit pokročilou úroveň metabolismu.

Z tohoto důvodu mnohokrát zvažujeme eukaryotické vektory pro naše klonovací experimenty. Vektory kvasinek, zvířat a rostlin jsou považovány za eukaryotické vektory.

Kvasinky (Saccharomyces cerevisiae) jsou jedním z nejdůležitějších organismů v biotechnol & shyogy. Jeho role je také velmi důležitá při vaření a výrobě chleba. Kvasinky byly použity jako hostitelský organismus pro výrobu důležitých léčiv z klonovaných genů. Vývoj a rozptyl klonovacích vektorů pro kvasinky byl výrazně stimulován objevem plazmidu, který je přítomen ve většině kmenů S. cerevisiae.

Byly navrženy různé kvasinkové vektory, jakmile se potvrdí schopnost a užitečnost kvasinek. Všechny mají tři společné rysy.

1. Všechny obsahují jedinečná cílová místa pro řadu restrikčních endonukleáz.

2. Všechny se mohou replikovat v E. coli často při vysokém počtu kopií.

3. Všechny používají markery, které lze použít k výběru rekombinantních kvasinek, např. Hi53, leo2, trpl a ura3.

Druhy kvasnicových vektorů:

Všechny kvasinkové vektory lze rozdělit do tří typů:

1. Kvasinkové klonovací vektory (nebo kvasinkové plazmidové vektory)

2. Kvasinkové expresní vektory

3. Kvasinkové umělé chromozomy (YAC)

Vektory pro klonování kvasinek (nebo vektory pro kvasinkové plazmidy):

Tyto vektory se používají ke klonování (vytvoření několika duplikátů) našeho požadovaného genu v kvasinkové hostitelské buňce. Všechny klonovací vektory byly vytvořeny z plazmidu 2fx, což je přirozeně se vyskytující plazmid v kvasinkové buňce.

Jsou následujících typů:

1. Kvasinkové epizomální plazmidy (YEps):

Je dlouhý 6 318 bp a má počet kopií 70-200. Většina YEps jsou shuttle vec & shytors (mohou být použity jako vektory jak v prokaryotických hostitelích, tak v eukaryotických hostitelích), a proto byly navrženy shodně a stydlivě. Příkladem YEps je Yep13.

Má následující části:

(a) Počátek replikace odvozený od 2m plas & shymid.

(b) amp R a tet R oblast z pBR322. Tato selektovatelná markerová oblast je užitečná pro screening rekombinantních hostitelských buněk, když je vektor použit v prokaryotické buňce.

(c) LEU2 oblast, která je odvozena z kvasinkového chromozomu a mohla by být použita jako selektovatelná, když je vektor použit v eukaryové a shyotické buňce. LEU2, který kóduje beta-iso-propyl-malátdehydrogenázu, jeden z enzymů podílejících se na přeměně kyseliny pyrohroznové na leucin.

To je velmi důležité si uvědomit, že když bereme kvasinkové buňky pro YEps, pak musíme brát pouze leu2 kvasinky, které musí být auxo & shytrophic mutanty s nefunkčním genem LEU2.

Leu2 - kvasinkové hostitelské buňky nejsou schopny syntetizovat a syntetizovat aminokyselinu leucin a mohou přežít, pouze pokud je tato aminokyselina dodávána jako živina a látka v růstovém médiu [obr. 4,41(a)]. Se­lekce je možná, protože hostitelské buňky trans-formantů obsahují kopii YEp (s genem LEU2) a jsou docela schopné růstu v nepřítomnosti aminokyseliny.

V klonovacím experimentu byly buňky Eire naneseny na minimální médium, které neobsahuje žádné přidané aminokyseliny. Pouze transformované buňky jsou schopny přežít a tvořit kolonie [obr. 4,41 (b)].

YEp může být vložen do kvasinkového chro­mozomu procesem homologní rekombinace mezi genem plazmidu LEU2 a genem kvasinkové mutanty LEU2. Plazmid může zůstat integrovaný nebo pozdější rekombinační událost může mít za následek jeho opětovné vyříznutí.

2. Kvasinkové integrativní plazmidy (YIps):

V zásadě se jedná o bakteriální plazmidy, které produkují kvasinkový gen. Příkladem je YIp5, což je pBR322 s vloženým genem URA3.

3. Kvasinkově replikativní plazmidy (YRps):

Ty se mohou množit jako nezávislé plazmidy, protože nesou chromosysomální sekvenci DNA, která obsahuje ori & shygin replikace. Příkladem je YRp7.

Vektory kvasinkového výrazu:

Tyto vektory se používají, když je naším cílem ex & shypress náš požadovaný gen v kvasinkové buňce. Kvasinkové expresní vektory budou kromě požadovaného genu využívat promotorové a terminátorové sekvence. Kromě nich máme genetické značky, jako je gen pro zelené fluorescenční a shycentní proteiny (GFP) pro sledování polohy proteinu po jeho biosyntéze.

Následuje několik příkladů:

Kvasinkový expresní vektor s vysokým počtem kopií nesoucí gen pro aminoglykosid fosfotransferázu pro selekci v kvasinkách pomocí G418. Vložky jsou exprimovány ze silného promotoru TEF.

Expresní vektor kvasinek s nízkou kopií nesoucí gen aminoglykosidové fosfotransferázy pro selekci v kvasinkách pomocí G418. Vložky jsou exprimovány ze slabého promotoru CYC1.

Kvasinkový expresní vektor pro sekretované proteiny. Silný promotor TEF1 řídí konstitutivní expresi cDNA fúzované s pre-pro vedoucí sekvencí pářícího faktoru alfa pro zajištění sekrece proteinového produktu do média.

Kvasinkové umělé chromozomy:

Kvasinkové umělé chromozomy (YAC) jsou syntetické dvouřetězcové lineární konstrukty obsahující prvky nezbytné pro replikaci jako nezávislé chromozomy v kvasinkách. Další podrobnosti viz umělé chromozomy.

Následuje několik příkladů zvířecích vektorů:

Baculovirus v & shyfects hmyzu. Tento virus má tyčový tvar s velkým dvouvláknovým genomem. Během běžných infekcí produkuje bakulovirus jaderná inkluzní tělíska, která se skládají z virových částic vložených do proteinové ma & shytrix.

Tato proteinová matrice se nazývá polyhedrin a tvoří 70% celkového pro & shyteinu kódovaného virem. Genetická manipulace a shylace virové DNA není možná, protože má velmi velkou DNA s mnoha restrikčními a shylačními místy pro jeden enzym.

Proto je požadovaný gen klonován do malého rekombinantního transferového vektoru a kotransfekován do hmyzích buněčných linií spolu s divokým typem viru v buňce. Homolo a plachá rekombinace probíhá mezi polyhedrinovým genem a naším genem inter & shyest.

Náš požadovaný gen bude tedy trans -shyferován z vektorového plazmidu do divokého typu viru a polyhedrinový gen bude přenesen z viru na plas & shymid.

Je to něco jako reakce na přemístění. Toto vytěsnění genu neovlivní replikaci viru, protože polyhedrinový gen není nutný pro replikaci. Rekombinační virus se replikuje v buňkách a vytváří charakteristické plaky (bez inkluzních tělísek).

Virus není ani shymally kultivován v hmyzí buněčné linii Spodopterafrugiperda. Požadovaný gen je exprimován během infekce a velmi vysokých výtěžků proteinu lze dosáhnout v době, kdy buňka lyžuje.

2. Vektor viru papilloma skotu:

Bo & shyvine papilloma virus (BPV) způsobuje u skotu bradavice (nekontrolovanou epiteliální proliferaci).

BPV normálně infikuje terminálně odlišné a shytiované dlaždicové epiteliální buňky.

BPV má kapsidový protein obklopující kruhovou dvouvláknovou DNA o velikosti 79 kb. 69 % tohoto genomu je důležitých pro virovou funkci, zatímco 31 % genomu může být nahrazeno jakoukoli cizí sekvencí DNA, jako je náš požadovaný gen.

Rekombinantní BPV je konstruován ligací našeho požadovaného genu a vektoru BPV (69%) na plazmid pBR 322, čímž se vytvoří kyvadlový vektor obsahující místo plazmidu ori a sekvence replikace viru. Tyto kyvadlové vektory jsou nejprve namnoženy v buňkách E. coli a poté jsou transformovány do myší buněčné linie.

Hlavní výhodou BPV je generování trvalé buněčné linie. Protože infikované buňky nejsou usmrceny, je nalezeno stabilní číslo plazmidu, i když je inzert velké velikosti. Výběr transformantů je velmi snadný, protože tvoří hromadu buněk na přenesené monovrstvě buněk zvaných “Zaostřeno”.

Transformované buňky jsou poté selektovány přítomností markerového genu, kterým je většinou gen neomy­cin fosfotransferázy kódující rezistenci vůči G418. Příkladem tohoto typu vektoru je p3.7LDL.

3. Vektory založené na viru SV40:

SV 40 je sférický virus s dvouvláknovou cir­kulární DNA o velikosti 5,2 kb. Virový protein obsahuje tři virem kódované proteiny. VP1 je hlavní protein přítomný v kapsidě o velikosti 47 000 kDa. K dispozici jsou také další dva pro & shyteiny VP2 a VP3.

DNA viru je spojena se čtyřmi proteiny histonů (H4, H2A, H2B a H3). Virovou DNA lze segmentovat do pěti přesných segmentů kódujících pět různých proteinů malých T, velkých T, VP1, VP2 a VP3. Kódovací oblast VP1 překrývá VP2 a VP3 v jiném čtecím rámci překladu. Virus SV 40 infikuje buněčné linie opičích ledvin.

Virus putuje do jádra a nepokryje se. Poté jsou oba T-geny umístěné poblíž původu přeloženy ve směru hodinových ručiček. Velký T pro & shytein je důležitý pro replikaci a shyting DNA viru a začíná po translaci velkého T -proteinu.

Replikace začíná v počátku a je obousměrná. Ukončí se, když se setkají dvě replikační vidlice. Na buňku se syntetizuje a shysizuje asi 105 molekul duplexní DNA. Spolu s replikací DNA se syntetizují a shysizují proteiny VP1, VP2 a VP3.

Poté dojde k zabalení DNA za vzniku nových virionů, které se uvolňují ly & shysis buňky. Celý proces může být také zahájen transfekcí nahou DNA SV 40. Vektory SV 40 jsou konstruovány podobně jako ve fágových vektorech. Části virového genomu jsou odstraněny a nahrazeny jinými segmenty DNA. Existují tři typy vozidel SV 40, z nichž každé má mezi sebou výraznou výhodu nebo nevýhodu.

(a) Pasivní transformační vektory SV40:

Tyto vektory nereplikují ani nevytvářejí viriony, ale jednoduše integrují segmenty DNA do buněčné DNA. Tyto transformované buňky replikují novou DNA jako nedílnou součást jejich vlastních genomů. Tyto plazmidy jsou také kyvadlové vektory a zahrnují selektivní markery, jako je herpes virus, thymidinkináza nebo neo geny.

Kromě selektivních markerů zahrnují signály transkripčního regulátoru a polyadenylační místa.

(b) SV40 transdukční vektory:

Tyto vec & shytors jsou schopné replikace a balení & shying do virionových částic. Transdukční vektory obsahují segment 300 bp, který funguje jako počátek replikace a poskytuje transkripční regulační signály pro syntézu mRNA.

Tento typ vektoru má insert o velikosti 3,9 až 4,5 kb. Tyto plazmidy nemají geny, které kódují VP1, VP2 a VP3. Protože do DNA SV 40 nelze přidat žádnou DNA, aniž by byla z genomu odstraněna jakákoli DNA, je pro přidání inzertu odebrána DNA genomu, která není vyžadována.

Funkce DNA, které jsou těmito delecemi ztraceny, jsou poskytovány pomocí pomocného viru nebo vložením SV 40 deletovaných genů do hostitelské DNA. Rekombinantní vektory SV 40 (obvykle sestávají z DNA in & shyterest a replikační sekvence a genu pro kódování VP1, VP2 a VP3) jsou normálně trans & shyformovány do buněčné linie cos.

Buněčná linie Cos je ledvinová buněčná linie ledvin zelené opice. V genomu je začleněn gen T-proteinu. Když je tedy vektor transfekován do těchto buněk, virionové částice se získají pomocí pomocného viru.

(c) Plazmidové vektory SV40:

Tyto vektory se množí v opičí buněčné linii, ale nejsou zabaleny jako viriony. Tyto vektory obvykle obsahují se­quence počátku replikace a větší gen T-proteinu, ale neobsahují geny VP1, VP2 a VP3. Jsou to kyvadlové vektory a mají schopnost množit se jak v E. coli, tak v opičí buněčné linii.

Klonovací vektory pro vyšší rostliny byly vyvinuty v 80. letech 20. století a jejich použití vedlo ke geneticky modifikovaným (GM) plodinám, které jsou dnes v titulku.

Zkoumáme detaily rostlinných hmot a shytorů a genetické modifikace plodin. Zde se podíváme na klonovací vektory a na to, jak se používají.

Byly použity tři typy klonovacích systémů a systémů s různým stupněm úspěchu u vyšších rostlin:

1. Vektory založené na přirozeně se vyskytujících plasmidech Agrobacterium (např. Ti plasmidech z A. tumifaciens a Ri plasmidu z A. rhizogens).

2. Přímý přenos genů pomocí různých typů plazmidové DNA. (např. použití superšroubovicových plazmidů).

3. Vektory na bázi rostlinných virů (např. Vektory viru Caulimo a vektory viru Gemini).

Vektory raketoplánu:

Vektory raketoplánu jsou ty, které se mohou množit do dvou různých nesouvisejících druhů. Kyvadlové reaktory jsou navrženy tak, aby se replikovaly v buňkách dvou druhů, protože obsahují dva počátky replikace, jeden vhodný pro každý druh, stejně jako geny, které jsou nutné pro replikaci a nejsou dodávány hostitelskou buňkou, tj. Jsou soběstačné s procesem jeho replikace.

Vektory raketoplánu jsou následujících typů:

1. Eukaryotické a#8211 prokaryotické raketoplány Vec a shytory:

Vektory, které se mohou šířit v eukaryotech a prokaryotech. například YEp vec & shytors mohou být množeny v kvasinkách (houby) i v E. coli (bakterie).

2. Prokaryotické – prokaryotické raketoplány Vec­tors:

Vektory, které mohou být propagovány ve dvou nepříbuzných prokaryotických hostitelských buňkách, např. vektory RSF1010, mohou být propagovány jak v bakteriích, tak i ve spirochetách.

Společné rysy takových raketoplánu a shytorů nebo eukaryotických vektorů jsou následující:

(a) Jsou schopné replikace do dvou nebo více typů hostitelů včetně prokaryotických a eukaryotických buněk.

(b) Replikují se autonomně, nebo se integrují do hostitelského genomu a replikují se, když se hostitelská buňka množí.

(c) Tyto vektory se běžně používají k transportu genů z jednoho organismu do druhého.

Přítomnost dvou počátků replikace některé & shytimes představuje zvláštní problémy, jedna část původu replikace jednoho druhu je zcela nesouvisející s jiným a interferuje s replikace a shylikací jiného hostitele. Proto je třeba do raketoplánu vec­tor vložit a před experimentováním zkontrolovat různé typy replikačních počátků.

Umělé chromozomy:

Umělé chromozomy jsou synteticky de­signované molekuly DNA známé struktury, které jsou sestaveny in vitro (v laboratoři) ze specifických sekvencí DNA, které působí jako přirozený chromozom. Umělé chromo a shysomy jsou kruhové nebo lineární vektory, které jsou stabilně udržovány v 1–2 kopiích na buňku.

Ve srovnání s jinými vektory jsou obrovské, ale mohou klonovat velmi velké segmenty chromozomů (dokonce celý chromozom). Než si prohlédneme různé typy umělých chromozomů, můžeme vidět tři klíčové složky eukaryotických chromozomů, které jsou nezbytné pro jeho stabilní udržení uvnitř buňky.

1. Centromera, která je nutná pro správnou distribuci chromozomu do dceřiných buněk během buněčného dělení.

2. Dvě telomery, struktury na koncích chromozomu, které jsou potřebné pro správnou replikaci konců, a které také zabraňují tomu, aby chromo a shysome byly okusovány exonem a shyclease.

3. Počátek replikace, což jsou polohy podél chromozomu, ve kterých začíná replikace DNA, podobně jako počátek replikace plazmidu.

Jakmile jsme definovali chromozomální strukturu eukaryotického organismu (jako hu & shymans a kvasinky), pak můžeme izolovat klíčové složky jejich chromozomů a spojit je dohromady, abychom vytvořili umělý chromo a shysome. Poté do tohoto umělého chromozomu můžeme vložit náš požadovaný gen, který lze následně klonovat v jeho příslušné buňce.

Fol­lowing jsou typy umělých chromozomů:

A. Kvasinkové umělé chromozomy (YAC):

YAC lze považovat za funkční umělý chromozom, protože obsahuje tři specifické sekvence DNA, které mu umožňují propagovat se z jedné kvasinkové buňky na její potomstvo:

Telomera, která se nachází na každém konci chromozomu, chrání lineární DNA před degradací nukleázami.

Centromera, která je místem připojení pro vlákna mitotického vřeténka, “vtáhne” jednu kopii každého du­plikovaného chromozomu do každé nové daugh­terovy buňky.

3. Origin of Replication(OR):

Sekvence počátku replikace, což jsou specifické sekvence DNA, které umožňují mechanismu replikace DNA sestavit se na DNA a pohybovat se na replikačních vidlicích.

Volitelné markery, které umožňují snadnou izolaci kvasinkových buněk, které zaujaly umělý chromozom.

Místo pro uznání dvou restrikčních en & shyzymů EcoRI a BamHl.

Klonovací experiment s použitím YAC vektoru:

1. Velké fragmenty DNA se získají car & shyrylingem restrikčního štěpení pomocí EcoRI.

2. YAC se štěpí dvěma restrikčními enzymy EcoRI a Bam HI.

3. Tyto dva prvky se rekombinují v místech EcoRI a jsou kovalentně spojeny DNA ligázou.

4. Vytvoří se rekombinantní vektor YAC, kvasinkový umělý chromozom s vloženou genomovou DNA. Tento vektor lze použít k infikování kvasinkových buněk a generování neomezeného počtu kopií.

1. YAC lze použít ke studiu různých aspektů struktury a chování chromozomů, například ke zkoumání segregace chromozomů během meiózy.

2. Klonovací systém YAC může mít inzert DNA větší než 1 000 kB. Díky tomu mohou být použity ke studiu funkcí a způsobů exprese genů, které dříve nebylo možné analyzovat technikami rekombinantní DNA.

3. YAC lze množit v savčích buňkách, což umožňuje provedení funkční analýzy v organismu, ve kterém gen normálně sídlí. Jejich použitím se tedy můžeme dozvědět o skutečné formě genové exprese in vivo podmínek.

4. Kvasinkové umělé chromozomy jsou velmi nápomocné při produkci genových knihoven. Vektory E. coli mohou mít vložený DNA maxi & shymum až 300 kB. Díky tomu je pro lidskou genovou knihovnu potřeba asi 30 000 klonů, pokud je použijeme jako klonovací vektor.

Nicméně vektory YAC se rutinně používají ke klonování fragmentů o velikosti 600 kb a speciální typy jsou schopny zpracovat DNA o délce až 1400 kb, což snižuje velikost knihovny lidských genů na pouhých 6500 klonů.

Někdy je YAC pozorován s problémem postrádající stabilitu inzertu, kdy se klonovaná DNA někdy přestavuje intra-molekulární rekombinací. Nicméně YAC měly nesmírnou hodnotu při poskytování dlouhých kusů klonované DNA pro použití ve velkých projektech sekvenování DNA. Příkladem YAC je pYAC3.

2. Bakteriální umělé chromozomy (BAC):

Bakteriální umělé chromozomy (BAC) jsou klonovací vektory založené na extrachromozomálních plazmidech E. coli, nazývaných F faktor nebo faktor fertility. Tyto vektory umožňují konstrukci umělých chromozomů, které lze klonovat do E.coli.

Tento vektor je užitečný pro klonování fragmentů DNA až do 350 kb, ale lze s ním zacházet jako s běžnými bakteriálními plazmidovými vektory a je velmi užitečný pro sekvenování velkých úseků chromozomální DNA.

Jako každý jiný vektor, BAC obsahují ori sekvence odvozené od faktoru F plazmidu E. coli, více klonovacích míst (MCS) s unikátními restrikčními místy a vhodné selektovatelné markery. Genomy několika velkých DNA virů a RNA vi­rusů byly klonovány jako BAC. Tyto konstrukce jsou označovány jako “ infekční klony ”, protože transfekce konstruktu BAC do hostitelských buněk je dostatečná k zahájení virové infekce.

Díky infekčním vlastnostem těchto BAC je studium mnoha virů, jako jsou herpetické viry, poxviry a koronaviry, přístupnější a dostupnější. BAC jsou nyní ve větší míře využívány při modelování genetických chorob, často po boku transgenních myší.

V této oblasti byly použity BAC, protože komplexní geny mohou mít několik regulačních sekvencí před kódující sekvencí, včetně různých promotorových sekvencí, které budou řídit úroveň exprese genu. BAC byly do určité míry úspěšně použity u myší při studiu neurologických onemocnění, jako je Alzheimerova choroba nebo jako v případě aneuploidie spojené s Downovým syndromem.

Příklady BAC jsou pBACe3.6, pBeloBAC11 atd.

3. Lidské umělé chromozomy (HAC):

Lidský umělý chromozom (HAC) je mini-chromozom, který je konstruován uměle a stylově v lidských buňkách. To znamená, že místo 46 chromozomů by buňka mohla mít 47, přičemž 47. je velmi malý, má velikost zhruba 6-10 megabází a je schopen nést nové geny zavedené lidskými výzkumníky.

HAC se může chovat jako stabilní chromosom, který je nezávislý na chromozomech hostitelských buněk, protože zakrývá své vlastní sebereplikující a segregační systémy.

Základními prvky pro údržbu a přenos chromozomů jsou následující tři oblasti:

1. Původ “ replikace, ”, od kterého du & shyplication DNA začíná,

2. The “centromera,” který funguje při správné segregaci chromozomů během buněčného dělení, a

3. “telomere, ”, který chrání konce lineárních chromozomů.

Jsou užitečné při expresních studiích jako vektory přenosu genů a jsou nástrojem pro eluci a shydating funkce lidského chromozomu. Pěstované v buňkách HT1080 jsou mitoticky a cytogeneticky stabilní až šest měsíců.

4. Umělý chromozom odvozený od Pl (PAC):

Jedná se o DNA konstrukty, které jsou odvozeny z DNA PI bakteriofága. Mohou nést velké množství (asi 100-300 kilobází) jiných sekvencí pro různé účely biologického inženýrství. Je to jeden typ vektoru používaný ke klonování fragmentů DNA (průměrná velikost inzertu 100 až 300 kb, 150 kb) v buňkách Escherichia coli.


WHO aktualizuje nomenklaturu variant SARS-CoV-2

Lisa Winterová
1. června 2021

Pojmenování variant SARS-CoV-2 bylo trochu fackovací. Různé databáze, které sdílejí sekvence viru, mají různé nomenklaturní normy. Například varianta, která se objevila ve Spojeném království, se na platformě Pango nazývá B.1.1.7, ale na Nextstrain se nazývá 20I/S: 501Y.V1. Včera (31. května) Světová zdravotnická organizace (WHO) oznámila, že varianty zájmu SARS-CoV-2 (VOI) a varianty zájmu (VOC) budou pojmenovány podle řecké abecedy pro účely veřejného diskurzu.

Protože B.1.1.7 byla první VOC označená WHO, nazývá se podle nového systému pojmenování Alpha. B.1.351, který pochází z Brazílie, se nyní nazývá Beta. Dvě další VOC jsou P.1, varianta poprvé identifikovaná v Brazílii a nyní označovaná jako Gamma, a B.1.617.2, která pochází z Indie, nyní nazývaná Delta. Šest VOI určených WHO zabírá Epsilon prostřednictvím Kappa v řecké abecedě. Úplný seznam bude udržován na webových stránkách WHO.

„Tyto [řecké] štítky nenahrazují stávající vědecké názvy (např. Názvy přidělené společnostmi GISAID, Nextstrain a Pango), které sdělují důležité vědecké informace a budou i nadále používány ve výzkumu,“ píše se v prohlášení WHO.

Podle WHO jsou názvy technických variant pro širokou veřejnost příliš matoucí, a tak se „lidé často uchylují k volání variant podle míst, kde jsou detekovány, což je stigmatizující a diskriminační“.

Nový systém pojmenování přichází dlouho poté, co byly popsány první varianty. Úředníci WHO tvrdí, že rozhodnutí přišlo po velké diskusi o tom, která konvence pojmenování by byla nejlepší. Agentura Reuters uvádí, že skupina zvažovala další možnosti včetně portmanteau, ovoce nebo řeckých božstev.

Podle STAT, skupina stojící za rozhodnutím byla složena z mnoha stejných lidí, kteří jsou v Mezinárodním výboru pro taxonomii virů. Ačkoli organizace pojmenovala SARS-CoV-2, variantní nomenklatura přesahuje její oficiální rozsah, a tak byl úkol ponechán WHO.

"Slyšel jsem, že je někdy docela problém se dohodnout na nomenklatuře," říká Frank Konings, vedoucí pracovní skupiny. STAT. "Byla to poměrně přímočará diskuse, abychom se dostali do bodu, kdy všichni souhlasili."


NOVÉ VELIKOSTI

The Databáze CGSC z E-coli genetická informace zahrnuje genotypy a referenční informace pro kmeny v kolekci CGSC názvy, synonyma, vlastnosti a poloha mapy pro geny, genový produkt informace a informace o konkrétních mutace a odkazy na primární literaturu. Veřejná verze databáze obsahuje tyto informace a lze na ni přímo dotazovat tento webový server CGSC DB. Potřebujete -li pomoc, použijte odkazy nápovědy umístěné nad a na každém formuláři dotazu, nebo nás kontaktujte přímo.


Podívejte se na video: BIO 06 - Bakteriální buňka (Červenec 2022).


Komentáře:

  1. Gordon

    jak jste si pozorně přečetli, ale nepochopili jste

  2. Gardasho

    A ty jsi se to tak pokusil?

  3. Shae

    Mýlíš se. Jsem si jistý. Zkusme to diskutovat. Napište mi v PM, mluví s vámi.

  4. Kigall

    Absolutně s tebou souhlasím. V tomto něco je, myslím, že je to dobrý nápad.

  5. Dov

    Response intelligibility

  6. Samusida

    Omlouvám se, ale podle mého názoru se mýlím. Dokážu bránit pozici.

  7. Aegis

    A co si počneme bez vašich velmi dobrých nápadů

  8. Witton

    Podle mého názoru se dopustíte chyby. Navrhuji to diskutovat. Napište mi v PM, budeme si promluvit.



Napište zprávu