Informace

Metody detekce NMR spektroskopie pro proteiny

Metody detekce NMR spektroskopie pro proteiny


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Narazil jsem na tabulku srovnávající citlivost různých detekčních metod v NMR spektroskopii: "Přímá", "DEPT" a "Inverzní", kde se "Inverzní" zdá být nejcitlivější.

Co přesně tyto různé metody jsou a jak se liší?


Ve většině případů, když provádíte experimenty NMR na proteinech, detekujete signál na protonech. I když se díváte na jiná jádra, nakonec přenesete magnetizaci na proton a ten signál zjistíte. Toto je prostě nejcitlivější metoda kvůli vysokému gyromagnetickému poměru 1H, a toto je metoda, která je na vašem obrázku označena jako „inverzní“. Toto je v podstatě výchozí způsob měření heteronukleárních spekter.

Přímá detekce znamená, že přímo pozorujete méně citlivé jádro jako 13C. To má určité výhody zejména u velkých proteinů, kde často musíte deuterovat protony, abyste mohli měřit cokoli užitečného.

DEPT je typ experimentu, kde se magnetizace přenáší z přímo připojených protonů na heteronukleus. To zvyšuje citlivost a umožňuje rozlišit CH a CH3 skupiny z CH2 skupiny


Strukturní biologie proteinů vázajících železo pomocí NMR spektroskopie

Zde přinášíme přehled strategií NMR, které byly navrženy v naší laboratoři, aby přispěly k zodpovězení některých základních otázek v anorganické strukturní biologii, počínaje počátečním využíváním paramagnetických omezení NMR pro stanovení strukturálních a dynamických vlastností malých izolovaných metaloproteinů, ke studiu ultraslabých interakcí protein-protein až ke studiu obchodování s hemem a železem. Recenzované příklady se zabývají úlohou některých metaloproteinů nebo proteinů vázajících kovy v základních biologických procesech. Příklady se zabývají makromolekulárními sestavami, které jsou obzvláště náročné pro aplikace NMR, pokud jde o jejich složitost.

Abstraktní

Pro zkoumání několika makromolekulárních sestav vázajících železo rostoucí velikosti a složitosti se využívá řada strategií NMR. Uvedené příklady jsou relevantní pro některé klíčové biologické procesy, jako je apoptóza závislá na cytochromu c, získávání hemu jako zdroje železa ve formě mikroorganismů a feritin zprostředkovaná biomineralizace železa.


Abstraktní

Jsou popsány dvě metody detekce interakcí protein-protein v roztoku pomocí jednorozměrné (1D) NMR spektroskopie. Obě metody se spoléhají na měření intenzity nejsilnější methylové rezonance (SMR), která je u většiny proteinů pozorována při 0,8 - 0,9 ppm. Silný rezonanční přesah v této oblasti usnadňuje detekci SMR při nízkých mikromolárních a dokonce submikromolárních koncentracích proteinu. Snížená intenzita SMR v1H NMR spektru proteinové směsi ve srovnání s přidanými intenzitami SMR izolovaných proteinů ukazuje, že proteiny interagují (metoda SMR). Snížení intenzity SMR v 1D13C editovaných 1H NMR spektrech 13C-značených proteinů po přidání neznačených proteinů nebo makromolekul také ukazuje vazbu (metoda SMRC). Analýza interakce mezi XIAP a Smac, dvěma proteiny zapojenými do apoptózy, ilustruje obě metody. Studie ukazující, že fosfolipidy soutěží s komplexem neuronálního jádra o Ca2+-dependentní vazbu na presynaptický Ca2+-senzor synaptotagmin 1 ilustruje užitečnost metody SMRC při studiu vícesložkových systémů.

Tato práce byla podpořena grantem od Welch Foundation a NIH Grant NS40944.

Komu by měla být korespondence určena. Telefon: (214) 648-9026. Fax: (214) 648-8673. E-mail: [email   protected]


Metody detekce NMR spektroskopie pro proteiny - biologie

NMR spektroskopie hraje klíčovou roli v procesu objevování a vývoje léčiv. Zde diskutujeme současné screeningové strategie založené na NMR, které se používají při hledání přístupů, po nichž následuje jejich validace a další zlepšení za účelem optimalizace vedení. Screeningové experimenty NMR jsou velmi účinné a všestranné při objevování ligandů s vysokou afinitou pro biologicky relevantní makromolekuly, objasňování vazebných míst ligandů, identifikaci malých molekul se širokým rozsahem vazebné afinity, a proto se ukazuje jako cenný a robustní nástroj v léku na bázi struktury design. Tyto metodiky NMR screeningu jsou založeny na pozorování cílových a ligandových rezonancí jako způsobu detekce pro identifikaci slabě se vážících sloučenin a napomáhají jejich postupu na účinné inhibitory podobné léčivům pro použití jako olověné sloučeniny při objevování léčiv.

Moderní objevování a vývoj léčiv je vícestupňový přístup, od hledání zásahů po optimalizaci potenciálních zákazníků. Tento přístup začíná identifikací „léčitelného“ cíle pro konkrétní onemocnění a testováním jeho platnosti. Jakmile je cíl vybrán, provede se počáteční screening na knihovně sloučenin za účelem identifikace zásahů, které se mohou vázat na cíl. Poté se vybrané sloučeniny olova z předběžného screeningu podrobí další optimalizaci na základě zlepšení vlastností těchto sloučenin olova, pokud jde o lepší účinnost, metabolickou stabilitu, afinitu, selektivitu, orální biologickou dostupnost a snížené vedlejší účinky. Sloučeniny olova, které jsou zařazeny do užšího výběru za účelem dosažení těchto vlastností, jsou dále podrobeny klinickým zkouškám.

Pro zkoumání procesu objevování a vývoje léků je nezbytné pochopení struktury biologických molekul na atomové úrovni, aby bylo možné tyto znalosti využít k návrhu kandidátů na léky, které je mohou zacílit. Spektroskopie nukleární magnetické rezonance (NMR) hraje zásadní roli při dosahování požadovaného cíle s vysokou mírou úspěšnosti při screeningu sloučenin, které lze použít jako potenciální lékové kandidáty k léčbě nemocí. Během posledního desetiletí byla NMR spektroskopie velmi účinným a všestranným nástrojem při objevování a vývoji léčiv, protože může objasnit molekulární strukturu biomolekul, objasnit a ověřit strukturu léčiv a poskytnout strukturní informace o interakci léčiv. biomolekuly (cíl) se sloučeninami s malou molekulou (ligandy), takže NMR spektroskopie se ukazuje jako skvělý nástroj ve farmaceutickém výzkumu [1], například biokatalytická výroba léčiva islatravir [2]. Vzhledem k tomu, že klinicky používanými léčivy jsou typicky přírodní nebo syntetické sloučeniny, je kvantitativní analýza pomocí NMR ve stavu roztoku docela užitečná při odhadu profilu kontaminace léčiv, popisu složení léčivých přípravků a zkoumání metabolitů léčiv v tělesných tekutinách nebo při studiu dynamika a kinetika proteinů na pevných površích [3, 4] nebo enzymová alosterie [5]. Metody NMR v pevné fázi mohou nabídnout znalosti o polymorfismu léčiv v práškové formě a jejich konformacích v tabletách nebo aktivním místě tryptofan syntázy [6] nebo o strukturálních vlastnostech toxických a netoxických typů a-synukleinových oligomerů [7 ]. Mikrozobrazení je užitečné při studiu rozpouštění tablet [8].

Tento přehled se zaměří hlavně na metody NMR stavu řešení implementované pro cílitelnost léčení, identifikaci a validaci zásahu s následnou optimalizací leadů v oblasti objevování a vývoje léčiv. V nedávné minulosti bylo zavedeno mnoho nových strategií založených na NMR za účelem zvýšení citlivosti metod pro dosažení vyšší propustnosti při identifikaci zásahu, validaci a optimalizaci leadů, stejně jako při vyhodnocování cílové léčivosti. Přehled screeningových metod NMR implementovaných při objevování a vývoji léčiv je uveden na obrázku 1. Screeningové metody založené na NMR zahrnují hlavně dva způsoby detekce založené buď na cílové rezonance nebo ligandové rezonance.

Screeningové metody NMR představují velmi spolehlivý a hodnotný nástroj pro identifikaci malých molekul a optimalizaci typu hit-to-lead. Knihovna sloučenin je testována na nalezení hitů, které se mohou vázat na specifický cíl, a poté následuje jejich validace, u kterých mohou mít testy vazby NMR vysokou účinnost. Tyto metody zahrnují následující.

V přístupu perturbace chemickým posunem [9] lze informace o intermolekulární interakci mezi sloučeninou (ligand) a proteinem (cíl) extrahovat na základě rozdílů v chemickém posunu mezi volným a vázaným proteinem. Tento rozdíl v chemickém posunu je generován v důsledku vazby sloučeniny na cílový protein, což způsobuje poruchu v chemickém posunu magnetických jader ve vazebném místě. Pro tuto metodu musí být cílový protein označen stabilními izotopy, 15N a/nebo 13C, pro získání 15N/1H a13C/1H dvourozměrného heteronukleárního korelačního NMR spekter volných a vázané formy proteinu [10, 11]. Jednotné izotopové značení proteinu je nezbytné pro zvýšení citlivosti a rozlišení a také pro snížení složitosti NMR spekter. Kromě toho také pomáhá při poskytování sekvenčního rezonančního přiřazení pomocí multidimenzionálních experimentů s trojitou rezonancí [12], které spolu s analýzou chemického posunu mohou poskytnout jednoznačnou identifikaci umístění vazebného místa ligandu na cílovém proteinu.

Tato metoda má tedy mnoho výhod. Kromě toho, že je velmi spolehlivý a reprodukovatelný, může poskytnout zásadní strukturální informace o místě vazby ligandu. Může detekovat sloučeniny s nízkou až vysokou afinitou k cíli (obecně sloučeniny s disociačními konstantami v rozmezí mM až nM), dokonce lze sondovat extrémně slabou vazbu. Disociační konstantu (Kd) lze měřit sledováním rezonance cíle jako funkce koncentrace ligandu v titračních experimentech a korelací frakční změny chemického posunu s celkovou koncentrací ligandu [13]. Pokud byla struktura cíle objasněna pomocí metod NMR, lze vzdálenost ligand-protein odvodit pomocí experimenty typu jaderného Overhauserova efektu (NOE) [14], což by umožnilo přesnější stanovení vazebného režimu ligandu.

Fesik a jeho spolupracovníci [15] zavedli další přístup založený na cílové rezonanci NMR, který snižuje složitost metod screeningu NMR a zvyšuje účinnost vysoce výkonného screeningu. V tomto NMR screeningu chemický posun methylové skupiny jsou pozorovány změny. Methylové skupiny v jednotlivých aminokyselinách jsou selektivně značeny13C a sledovány prostřednictvím změn chemického posunu 13C/1H methylových rezonancí ve 2D 13C-1H HSQC spektrech [15]. Tento přístup je výhodný z hlediska trojnásobného zvýšení citlivosti ve srovnání s experimenty založenými na 15 N/ 1H změně chemického posunu a nabízí komplementární přístup k takovým experimentům, zejména když jsou ligandy umístěny v blízkosti valinových, leucinových nebo izoleucinových methylových skupin. Dále je možný screening proteinových cílů s vysokou molekulovou hmotností (MW > 50 kDa) se selektivním značením methylovými skupinami v perdeuterovaném rozpouštědle.

Metody NMR screeningu založené na ligandové rezonanci jsou rozmanitější než přístupy založené na cílech, a proto mají další výhody, například tyto experimenty nevyžadují proteiny značené izotopy, je zapotřebí pouze malé množství proteinu, pro experimenty, protože jsou obecně jednorozměrné a nikoli dvourozměrné experimenty požadované pro přístup založený na cíli, a neexistuje žádný horní limit velikosti cíle pro screening. Fluorová NMR spektroskopie má však problém s reprodukovatelností kvůli konstrukci spektrometru a systému stupnice pro kalibraci heteronukleárních NMR spekter bez vnitřního odkazování [16].

Saturační přenosový rozdíl (STD) NMR experiment zahrnuje selektivní ozařování protonových rezonancí proteinu pomocí Gaussova pulzního sledu. Nasycení se rychle šíří celým proteinem díky efektu spinové difúze. Pokud se ligand váže na protein, je saturace také přenesena na vázaný ligand zkříženou relaxací na rozhraní ligand-protein, což vede k útlumu intenzity ligandového signálu. STD spektra obsahující signály vazebných ligandů se získají odečtením výsledného spektra od referenčního spektra bez nasycení [17]. Tato metoda pomáhá při mapování epitopů (určení farmakoforických skupin) přímých vazebných segmentů ligandu a identifikaci ligandu přímo ze směsi sloučenin.

Water-Ligand Observed via Gradient SpectroscopY (WaterLOGSY) je cenná metoda pro identifikaci ligandu, který se váže na cílovou biomolekulu. V tomto experimentu NMR je magnetizace přenesena z hromadné vody přes komplex protein-ligand na volný ligand. Rezonance vázaného ligandu se jeví s opačným znaménkem než rezonance nevázaných ligandů, a proto jsou velmi užitečné pro primární NMR screening [18]. Tato metoda má však například určité nevýhody, neposkytuje informace o vazebném místě ligandu. Rovněž není schopen identifikovat ligandy se silnou vazebnou afinitou k cíli a pomalými rychlostmi disociace. K překonání tohoto problému je navržen další experiment vazby, tj., Competition Water-Ligand Observed via Gradient SpectroscopY (c-WaterLOGSY) [19], která umožňuje detekci silných pojiv. Tento experiment je použitelný pro identifikaci potenciálních silných inhibitorů s mírnou rozpustností, protože vyžaduje nízkou koncentraci ligandu. Tato technika je převážně vhodná pro rychlý screening chemických směsí a výtažků z rostlin nebo hub. Je pozoruhodné, že podobný přístup založený na kompetici by mohl být aplikován na mnoho dalších metod NMR screeningu s detekovaným ligandem. Základní princip kompetitivních experimentů [20] nejprve zahrnuje identifikaci referenční sloučeniny se střední až nízkou afinitou k cíli, který se váže na cílový protein, následovanou jejím vytěsněním jiným testovaným ligandem, který se váže na stejný cíl. s vyšší afinitou. Tyto screeningové metody založené na kompetici mají tedy další výhody týkající se konvenčních metod, jako je pomoc při identifikaci ligandů s vysokou afinitou, které nejsou detekovány konvenčními metodami, detekce ligandů, které se vážou na aktivní místo proteinu, a tím se vyhýbají nespecifické vazbě ligandy.

Spin Labels Attached to Protein Side chain as Tool to Identify Interacting Compounds (SLAPSTIC) je užitečný a citlivý pro primární screening sloučenin pomocí NMR, protože intermolekulární interakce mezi ligandem a proteinem lze identifikovat a charakterizovat pomocí spinových značek [21]. Rotační štítky (např.(paramagnetický organický nitroxidový radikál TEMPO) jsou kovalentně připojeny k proteinu a způsobují zlepšení paramagnetické relaxace (PRE) ligandových rezonancí, pokud jsou blízko (obecně až do vzdálenosti 15-20 A), aby roztočily značené skupiny. Například malý ligand v roztoku má obecně ostré NMR rezonance. Když se váže k paramagnetickému cílovému proteinu značenému spinem, dojde k významnému snížení intenzity rezonance v důsledku PRE efektu spinovým značením na ligandu [22].

Proces Target Imobilized NMR Screening (TINS) je rychlý, citlivý a identický pro každý cíl bez ohledu na jeho velikost a chemické složení. V tomto způsobu jsou ligandy skrínovány na základě jejich vazebné schopnosti k imobilizovanému proteinovému cíli. Směs sloučenin z chemické knihovny se aplikuje na cíl imobilizovaného proteinu a vazba se detekuje porovnáním výsledného 1D NMR spektra se spektrem vhodného kontrolního vzorku [23]. Tato metoda byla validována pro různé ligandy, které cílí na proteiny a nukleové kyseliny s KD od 60 do 5 000 μM. Pro rychlou charakterizaci místa vázajícího ligand lze TINS ​​použít v kompetitivním režimu. Tato metoda má několik výhod. Vyžaduje menší množství cílového proteinu ve srovnání s jinými přístupy založenými na fragmentech, protože protein může být znovu použit pro screening knihovny sloučenin. Je citlivý na vazbu ligandu na cíl se širokou škálou afinit, a proto pravděpodobně nepřehlédne nové zásahy. Kromě toho lze eradikovat slabou vazebnou interakci a vazbu ligandů na jiná alosterická místa s nízkou afinitou. Velmi vysoké úrovně specificity lze dosáhnout opatrným výběrem kontrolního vzorku. Může být také užitečný pro screening tvrdých cílů, jako jsou membránové proteiny, které se obtížně vyrábějí nebo jsou nerozpustné.

Relaxační editované experimenty NMR slouží k monitorování širokého rozsahu afinity ligandu. Protože vazba ligandu na cílový protein mění relaxační čas, umožňuje to odhad afinity a interagující funkční skupiny jsou identifikovány pomocí křivek tvorby. Tento přístup NMR upravovaný relaxací [24] zahrnuje podélnou relaxační dobu nukleárního spinu rotujícího rámce (T.1ρ) a relaxační čas příčného jaderného spinu (T2) měření jako způsob detekce. Například cílová (proteinová) molekula je obecně velká, a proto má pomalou translační difúzi, pomalé omílání, rychlou relaxaci, kratší T2, široké šířky čar a negativní NOE, zatímco ligandy jsou malé molekuly a mají rychlou translační difúzi, rychlé omílání, pomalou relaxaci, delší T2, úzké šířky čar a pozitivní NOE. Když se ligand váže s proteinem při rychlé výměně, difunduje méně rychle a rychle se uvolňuje, bude u ligandu pozorován negativní NOE, protože získá NMR vlastnosti podobné vlastnostem cíle a rezonanční čáry se rozšíří, což dává jasnou označení vazby.

Difúzní editované NMR experimenty zahrnují měření rychlostí difúze ligandů ve vázaném a volném stavu. Protože ligand ve volné formě difunduje rychleji než vázaná forma kvůli rozdílům ve velikosti, může být tato vlastnost využita při screeningu ligandů, které se mohou vázat na cíl. Pro tento typ experimentu se používají difúzní filtry založené na experimentech s gradientem pulzního pole (PEG) stimulovaných echo (STE) [24]. BT Falk et al například použili 1D a difúzní profilovací metody k optimalizaci ultrarychle působící inzulínové formulace [25].

Transporter Nuclear Overhauser effect (Tr-NOEs) je užitečný screeningový nástroj k rozlišení ligandů od směsi sloučenin, které se mohou vázat na daný cílový protein, nebo k identifikaci párů molekul, které se váží na protein souběžně na alosterických místech (interligandové NOE). Pokud má ligand nízkou afinitní vazbu nebo slabé interakce s cílovým proteinem, může být vynikající alternativou metoda přenesené NOE (trNOE) spektroskopie [26]. TrNOE poskytuje informace o orientaci ligandu v místě vazby na protein. Dvě z výše uvedených technik, STD a Water-LOGSY, jsou založeny na experimentech typu transfer-NOE.

NOE Pumping může poskytnout spolehlivé znalosti o interakcích protein-ligand bez potřeby izotopového značení nebo chemické separace. V těchto experimentech se magnetizace přenáší z proteinu na vázané ligandy nebo naopak a informace o interakcích protein-ligand se získávají interakcemi dipól-dipól mezi nimi. Magnetizace přenesená z proteinu vzniká ve volných ligandech v důsledku rychlé výměny mezi volnými (pomalá relaxace) a vázanými (rychlá relaxace) ligandy, což vede k pumpovacímu efektu pro NOE [27]. Tato metoda má však určitá omezení, například že podstatný rozdíl v příčných relaxačních časech nebo difúzních koeficientech mezi cílem a ligandy je nezbytný a vazebná interakce mezi volným a vázaným stavem ligandu musí být v režimu rychlé výměny na Časová stupnice NMR.

Afinitní značky Test vazby NMR může detekovat interakci protein-protein pomocí afinitních značek [28]. V tomto přístupu je jeden z partnerů vázajících protein připojen k doméně vázající ligand se střední afinitou k ligandu. Interakce mezi proteinem a jeho potenciálním vazebným partnerem je sondována prostřednictvím změn relaxační rychlosti ligandu, který je reverzibilně vázán na doménu vázající ligand. Změna rychlosti relaxace ligandu je určena molekulovou hmotností a molárním poměrem ternárního komplexu protein-protein-ligand. Hlavní výhodou této metody je relativně malé množství neznačeného proteinu, které je zapotřebí.

Fluorinová anizotropie chemického posunu a výměna za screening (FAXS) je spolehlivá, vysoce reprodukovatelná, 19F NMR screeningová metoda na bázi ligandu s velkým dynamickým rozsahem [29]. Základním principem této metody je, že když se kompetitivní ligand naváže na cílový protein, vytlačí fluorovanou špionážní molekulu, která je na něj již navázána. Signál fluorované špionážní molekuly, který byl široký, zpočátku nabývá na ostrosti díky svému vytěsnění z receptorových proteinů a je detekován pomocí 19F NMR. Tato metoda má významné výhody oproti původním přístupům založeným na konkurenci pomocí 'H NMR. Například screening směsi sloučenin se stává snadnějším díky absenci spektrálního překrývání a vyžaduje nízkou spotřebu proteinu. Velká anizotropie fluoru s chemickým posunem a významný příspěvek výměny pomáhá při výběru špionážní molekuly se slabou afinitou, což má za následek nižší práh vazebné afinity pro identifikované zásahy NMR.

Tři atomy fluoru pro biochemický screening (3-FABS) je 19F NMR metoda založená na substrátu [30] používaná hlavně pro funkční screening reakcí inhibice enzymů. V této metodě CF3-značený substrát se používá k provedení enzymatické reakce, ve které CF3 skupina se používá jako skupina senzorů. Chemická modifikace substrátu enzymem indukuje změnu elektronického oblaku CF3 části substrátu, což vede k zřetelným 19F chemickým posunům pro substrát a enzymaticky modifikovaný reakční produkt. Tato technika se používá hlavně pro monitorování enzymatických reakcí. Umožňuje rychlý a spolehlivý funkční screening knihoven sloučenin a přesné měření hodnot IC50 [31].

Screeningové metody NMR mají široké uplatnění během procesu optimalizace svodu ke zlepšení farmakokinetických vlastností ligandu. Protože získané zásahy jsou obecně slabými pojivy, je nezbytná jejich optimalizace, čehož lze dosáhnout pěstováním, spojováním nebo propojováním ligandů. Metody NMR mohou poskytnout vysoce kvalitní strukturní informace pro komplexy slabě vázaných ligandů a také se používají k charakterizaci proteinů, které nekrystalizují. NMR metody pro optimalizaci vedení mají také dva způsoby detekce, cílové rezonance a ligandové rezonance.

Cílová rezonance zahrnuje Structure-Activity Relationship (SAR) podle NMR [32, 33] je přístup spojený s fragmentem ke zvýšení vazebné afinity ligandu. V této metodě jsou ligandy identifikovány z knihovny sloučenin pomocí 1H-15N HSQC experimentu na základě jejich vazebné afinity k cíli a poté jsou optimalizovány pomocí chemické modifikace. V přítomnosti nasycených množství dříve optimalizovaného prvního ligandu se provede identifikace druhého ligandu spolu s jeho optimalizací pro druhé místo. Nakonec jsou oba ligandy kovalentně spojeny, aby se získal ligand s vysokou afinitou, který se může vázat na dvě sousední místa, a vazba ligandu je testována mapováním chemického posunu. Tato technika má široké použití, protože strukturní informace získané pro dvě hlavní sloučeniny jsou docela užitečné při chemické syntéze bidentátního ligandu s vyšší afinitou.

H2O/D2Měření směnného kurzu O je užitečné při identifikaci vazebného epitopu [34]. V této metodě se měří rychlost výměny kovalentně vázaného atomu vodíku (amidový proton hlavního řetězce proteinu) s atomem deuteria nebo naopak. Za tímto účelem se provádí výměnná reakce pro volný protein a jeho komplex s jeho ligandem. Pokud se ligand váže na cílový protein, amidové protony na vazebném místě budou chráněny v komplexu a pomalu se vyměňují. Takto jsou směnné oblasti porovnány a lze měřit směnný kurz.

Pro optimalizaci sloučeniny olova spojovacím procesem je nutné, aby se dva ligandy vázaly v blízkosti sebe. Obecně se ligandy snadno připojují k primárnímu vazebnému místu proteinu. Vazače druhého místa však mají mnohem slabší afinitu než pojiva prvního místa pro cíl, a proto je jejich detekce obtížná. Existuje několik metod založených na NMR, diskutovaných níže, které mohou tyto slabé interakce spolehlivě detekovat, (ii) Ligandový rezonanční přístup zahrnuje:

SLAPSTIC s metodou spin-značeného ligandu v prvním místě využívá efekt zesílení paramagnetické relaxace (PRE) a je velmi užitečný při identifikaci vazebných látek druhého místa prostřednictvím paramagnetických spinových značek na ligandu. Při této metodě je ligand prvního místa značen paramagnetickým činidlem, např., TEMPO, a používá se jako sonda pro screening pojiv druhého místa. Ligandy, které se vážou k druhému místu, jsou blízko k prvnímu místu ligandu, a proto je v NMR signálech pozorováno rozšíření linie v důsledku zesílení paramagnetické relaxace. Tato metoda je robustní, protože PRE efekt je detekovatelný pouze tehdy, když se oba ligandy vážou na svá příslušná místa, současně nebo blízko sebe, což činí screening spolehlivější [35].

Další metoda identifikace pojiv druhého místa je založena na meziligandovém NOE (ILOE) [36]. V této metodě se při vysoké koncentraci pojiv v prvním místě provádí screening na vazače druhého místa a experimenty typu NOESY detekují intermolekulární NOE ligand-ligand. ILOE jsou pozorovány pouze tehdy, jsou-li vazače prvního a druhého místa blízko (

5 Å). Tato metoda má však nevýhodu v tom, že jsou pozorovány slabé ILOE, protože ligandy druhého místa se vážou s nízkou afinitou a pojiva prvního místa mají často špatnou rozpustnost, která brání nasycení vazebného místa. Doporučují se vysoké koncentrace ligandů druhého místa a NOESY s delší dobou míchání (200-600 ms).

SAR ILOE detekuje interakci mezi dvěma ligandy vázajícími se na stejný protein, ale na sousední místa [37]. Identifikuje první slabé zásahy, které jsou vylepšeny přístupy chemické modifikace do bi-dentátních ligandů s vyšší afinitou, pomocí informací z proteinem zprostředkovaných NOE ligand-ligand (ILOE) ve složitých směsích. Touto metodou lze z jediného NOESY experimentu získat informace jak o ligandech, které se k sobě vážou, tak o částech ligandů, které se k sobě vážou proximálně. Tento experiment však vyžaduje delší dobu míchání (300-800 ms), aby se maximalizovala detekce ILOE.

Pharmacophore by ILOEs také detekuje proteinem zprostředkovanou interakci ligand-ligand a využívá informace pro farmakoforové vyhledávání možných spojených molekul z velkých databází komerčně dostupných sloučenin [38]. Toto vyhledávání založené na farmakoforu, řízené experimentálními vazebnými daty slabě interagujících ligandů, by mohlo mít vysokou účinnost při identifikaci nebo syntéze selektivních ligandů s vysokou afinitou.

Meziligové NOE pro PHARmacophore MApping (INPHARMA) detekuje proteinem zprostředkovanou interakci ligand-ligand na základě kompetice mezi dvěma ligandy o stejné vazebné místo [39]. V této metodě jsou pozorovány interligandové NOE mezi dvěma kompetitivními ligandy A a B, které se vážou na stejný cíl. Takové interligandové NOE účinky jsou zprostředkovány spinovou difúzí z ligandu prvního místa přes proteinové protony a zpět k ligandům, které soutěží s ligandem prvního místa o stejné vazebné místo. Tyto informace by mohly být použity ke stanovení relativní orientace kompetitivních ligandů ve vazebné kapse cílového proteinu.

Kromě výše uvedených screeningových metod NMR existují některé další metody, které uplatňují mírně odlišné přístupy k optimalizaci vedení. Tyto zahrnují

Screening SHAPES: V posledních letech tato metoda screeningu převládá ve farmaceutickém výzkumu. Tato strategie kombinuje NMR screening knihovny malých molekul podobných lékům s různými doplňkovými technikami, jako je virtuální screening, vysoce výkonné enzymatické testy, kombinatorická chemie, rentgenová krystalografie a molekulární modelování při hledání nových vodítek. V tomto přístupu se posuzuje vazba malých, ale různorodých molekul podobných léku k cíli, aby se našlo vedení. Scaffold pro malé molekuly je odvozen hlavně z tvarů nebo struktur, které se běžně vyskytují u úspěšných léků [40].

Metoda NMR SOLVE (Structurally Orientated Library Valency Engineering) zahrnuje přístup fragmentace spojující identifikaci ligandů pro rodiny enzymů [41]. Je založen na selektivním značení izotopů na specifických aminokyselinách proteinu za účelem pozorování a přiřazení pouze několika kritických protonů ve vazebném místě. Tento přístup proto usnadňuje odvození strukturních informací komplexu protein-ligand, i když chybí úplné přiřazení. Tuto techniku ​​lze použít na velkou rodinu proteinů, které mají společné vazebné místo, sousedící s variabilním vazebným místem, které je konzervované v celé rodině. Je vybrán reprezentativní člen rodiny proteinů a selektivní izotopové značení je provedeno na specifických aminokyselinách přítomných ve společném vazebném místě tohoto proteinu. Vazebné místo tohoto proteinu je mapováno běžným referenčním ligandem, aby se získala přiřazení rezonance pro značené zbytky ve vazebném místě, zejména na rozhraní mezi společným vazebným místem pro ligand a místem substrátu. Linker je navržen na základě orientace standardního mimického referenčního ligandu ve vazebném místě proteinu. Tento linker je nasměrován do sousedního vazebného místa pro substrát a je konstruována objektově orientovaná biligandová knihovna. Tato výsledná knihovna je vhodná pro použití u všech členů rodiny enzymů. Tato technika je užitečná při syntéze kombinatorické biligandové knihovny, která může být skrínována za účelem identifikace specifických vysokoafinitních biligandových inhibitorů.


NOVÉ NMR PŘÍSTUPY PRO VÝZKUM IDP/IDRS

Až donedávna byla většina experimentů pro biomolekulární NMR studie založena na přímé detekci 1H díky vysoké citlivosti 1H díky velkému gyromagnetickému poměru protonů (24, 25). Protony jsou však ty, které jsou charakterizovány skutečně nižší disperzí chemického posunu, která zvyšuje průchod na 13 C a na 15 N (obr. 1). To platí zejména pro jádra páteře, která jsou více ovlivněna příspěvky k chemickému posunu sousedních aminokyselin, čímž se zvyšuje disperze chemického posunu také v nepřítomnosti stabilní 3D struktury. Použití izotopového obohacení ve 13 C a 15 N, které se nyní stalo rutinně používaným, tedy výsledky zvláště důležité pro studium IDP. The presence of solvent exposed conformations typical of IDP states also affect to a smaller extent the nonexchangeable heteronuclei compared to exchangeable protons, the latter being more prone to exchange broadening.

The intrinsically different properties of 1 H and 13 C nuclei are shown schematically. The increasing chemical shift dispersion of 13 C NMR compared to 1 H NMR as well as the reduced sensitivity to specific relaxation mechanisms that may cause extensive line broadening make them well suited to investigate IDPs.

Heteronculei were always exploited in indirect dimensions of NMR experiments through the so-called “indirect detection methods” based on 1 H detection ( 26 , 27 ). The recent improvements in instrumental sensitivity ( 28 ), in parallel to the development of suitable experimental schemes, have stimulated the development of a whole set of multidimensional NMR experiments based on 13 C direct detection, that take maximum advantage of the properties of heteronuclei as only heteronuclei are frequency labeled in all dimensions of the experiments and are thus generally referred to as “exclusively heteronuclear experiments” ( 29-31 ). To appreciate the improvement in the resolution and information content of the different experimental schemes, Fig. 2 compares the simplest 2D experiments correlating the backbone 15 N, with the directly bound 1 H or carbonyl 13 C. It is clear that the latter is characterized by improved chemical shift dispersion, and that also proline residues which are very abundant in IDPs/intrinsically disordered regions (IDRs) can be easily detected. These characteristics will of course propagate to the whole set of 3D experiments that can be designed ( 32-34 ). Indeed, by exploiting the multitude of spin–spin interactions, it is possible to design a whole suite of experiments that enable the identification of spin-systems as well as to link them in a sequence specific manner (Fig. 3). The suite of exclusively heteronuclear NMR experiments has by now been used to study several IDPs ( 35 , 36 ). Of course, in case of a complex system, it is important to combine all the information that can be accessible, so the best strategy consists in the combination of the 1 H- and 13 C-detected multidimensional NMR experiments ( 34 , 35 , 37 ).

The two NMR experiments correlating the backbone amide either to the directly bound proton (left panel – 1 H- 15 N HMQC) or to the directly bound carbonyl (right panel - 13 C- 15 N CON to obtain (right panel: 13 C- 15 N CON) acquired at 900 MHz on a 0.2 mM sample of 13 C, 15 N labeled synuclein are shown. The two spectra clearly show the large chemical shift dispersion in the nitrogen indirect dimension as well as the reduced cross-peak overlap in the CON spectrom.

The various scalar couplings that can be exploited to design multidimensional NMR experiments, as well as the correlations expected in several 13 C detected exclusively heteronuclear experiments are shown on the right panel. The increase in resolution by progressively expanding the dimensionality of NMR experiments is schematically depicted on the left.

The NMR experiments have been further improved by implementing several clever approaches to reduce the experimental time and/or increase the resolution of the experiments (Fig. 4). Indeed, the selective manipulation of the different sets of spins enables to accelerate the recovery of the magnetization along the z-axis (longitudinal relaxation enhancement, LRE), ( 32 , 38-40 ) drastically reducing the amount of time needed between acquisition of an free induction decat and the following one, which is generally the longest delay in any NMR pulse scheme. Therefore, through this approach, the overall experimental time to obtain a specific kind of information can be drastically reduced. The other feature that has a high impact on the overall duration of a multidimensional NMR experiment consists in the number of repetitions of the same basic experiment necessary to construct indirect dimensions, until recently implemented by increase of a specific delay by a determined value in a regular way (on-grid sampling). Indeed, to achieve a good resolution, a key aspect for IDPs, each additional dimension causes an increase of about two orders of magnitude in the experimental time which means that experimental times increase from seconds/minutes for 1D experiments to minutes/hours for 2D experiments, to several hours to a few days for 3D experiments and so on, making higher dimensionality experiments either very poorly resolved or impossible. Several alternates to conventional on-grid sampling of points in indirect dimensions have been proposed and implemented to reduce the time necessary for each additional indirect dimension, still retaining good resolution ( 41-44 ). The large heteronuclear chemical shift dispersion makes exclusively heteronuclear experiments particularly well suited for the exploitation of reduced or sparse sampling methods in the indirect dimensions ( 32 , 36 ). These approaches combined with the LRE enable acquisition of multidimensional experiments with each additional dimension providing an increase in cross peak dispersion and information content ( 45 ). All these features (Fig. 4) are being implemented in a variety of experiments that now provide a robust tool that enables the study at atomic resolution of IDPs as large as several hundreds of amino acids ( 34 , 37 , 46 ), something unthinkable until a few years ago.

A schematic representation of the key approaches recently proposed to reduce the experimental time and/or increase the resolution of NMR experiments. The main determinants of the overall duration of an experiment are the longitudinal relaxation delay as well as the number of data-points necessary (repetitions of the same basic pulse scheme) to construct indirect dimensions. The longitudinal relaxation delay can be drastically reduced by selective manipulation of a subset of spins, promoting faster recovery to equilibrium (top). As an experimental proof, inversion recovery profiles acquired on a standard protein sample (ubiquitin) are shown on the right hand side for the H N and H α of residue 56 with the selective (pink/purple) and non selective modes. The reduction in the number of data-points acquired to construct indirect dimensions of NMR experiments is also schematically depicted in the bottom of the figure. As an example, the (H)CANCO could be acquired in 15 h (right) instead of 72 h (left).


Solid-state NMR analysis of membrane proteins and protein aggregates by proton detected spectroscopy.

Solid-state NMR has emerged as an important tool for structural biology and chemistry, capable of solving atomic-resolution structures for proteins in membrane-bound and aggregated states. Proton detection methods have been recently realized under fast magic-angle spinning conditions, providing large sensitivity enhancements for efficient examination of uniformly labeled proteins. The first and often most challenging step of protein structure determination by NMR is the site-specific resonance assignment. Here we demonstrate resonance assignments based on high-sensitivity proton-detected three-dimensional experiments for samples of different physical states, including a fully-protonated small protein (GB1, 6 kDa), a deuterated microcrystalline protein (DsbA, 21 kDa), a membrane protein (DsbB, 20 kDa) prepared in a lipid environment, and the extended core of a fibrillar protein (α-synuclein, 14 kDa). In our implementation of these experiments, including CONH, CO(CA)NH, CANH, CA(CO)NH, CBCANH, and CBCA(CO)NH, dipolar-based polarization transfer methods have been chosen for optimal efficiency for relatively high protonation levels (full protonation or 100 % amide proton), fast magic-angle spinning conditions (40 kHz) and moderate proton decoupling power levels. Each H-N pair correlates exclusively to either intra- or inter-residue carbons, but not both, to maximize spectral resolution. Experiment time can be reduced by at least a factor of 10 by using proton detection in comparison to carbon detection. These high-sensitivity experiments are especially important for membrane proteins, which often have rather low expression yield. Proton-detection based experiments are expected to play an important role in accelerating protein structure elucidation by solid-state NMR with the improved sensitivity and resolution.


Homonuclear NMR

If the proteins of interest are unlabeled, correlation spectroscopy (COSY) is performed two types of COSY are total correlation spectroscopy (TOCSY) and nuclear Overhauser effect spectroscopy (NOESY). 12 These two-dimensional NMR&rsquos provide two-dimensional spectra. 12 Both axes are chemical shifts, in term of units. 12 These experiments build spin systems, a list of resonances of the chemical shift of protein&rsquos protons. 12 To link the spin systems in the right pathway, NOESY must be used, which uses spin-lattice relaxation. 12 Magnetization is transferred via space in NOESY, which can be used to calculate distance relations. 12 NOESY can also determine chemical and conformational changes. 12 Peak overlap is an issue with homonuclear NMR as a result, it is limited to small proteins. 12

Figure (PageIndex<1>)0. Comparison of two-dimensional COSY and two-dimensional TOCSY spectra for an amino acid (e.g. glutamate or methionine). TOCSY displays diagonal cross-peaks between all protons. COSY only displays cross-peaks between neighbors. This image is from: upload.wikimedia.org/wikiped. /Tocsycosy.jpg it was created by Kjaergaard using GIMP. Figure (PageIndex<1>)1. Two-dimensional NMR displaying the Nuclear Overhauser effect between two nuclei, G and R. The NOE is measured by the blue peak intensity at (r,g) and (g,r) This image is from: https://users.cs.duke.edu/


ASJC Scopus subject areas

  • APA
  • Standard
  • Harvard
  • Vancouver
  • Autor
  • BIBTEX
  • RIS

Výstup z výzkumu: Příspěvek do časopisu ›Článek› peer-review

T1 - Application of NMR methods to identify detection reagents for use in development of robust nanosensors.

AU - Krishnan, Viswanathan V

N2 - Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a powerful technique for studying bimolecular interactions at the atomic scale. Our NMR laboratory is involved in the identification of small molecules, or ligands, that bind to target protein receptors such as tetanus neurotoxin (TeNT) and botulinum neurotoxin, anthrax proteins, and HLA-DR10 receptors on non-Hodgkin lymphoma cancer cells. Once low-affinity binders are identified, they can be linked together to produce multidentate synthetic high-affinity ligands (SHALs) that have very high specificity for their target protein receptors. An important nanotechnology application for SHALs is their use in the development of robust chemical sensors or biochips for the detection of pathogen proteins in environmental samples or body fluids. Here we describe a recently developed NMR competition assay based on transferred nuclear Overhauser effect spectroscopy that enables the identification of sets of ligands that bind to the same site, or a different site, on the surface of TeNT fragment C (TetC) than a known "marker" ligand, doxorubicin. Using this assay, one can identify the optimal pairs of ligands to be linked together for creating detection reagents, as well as estimate the relative binding constants for ligands competing for the same site.

AB - Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a powerful technique for studying bimolecular interactions at the atomic scale. Our NMR laboratory is involved in the identification of small molecules, or ligands, that bind to target protein receptors such as tetanus neurotoxin (TeNT) and botulinum neurotoxin, anthrax proteins, and HLA-DR10 receptors on non-Hodgkin lymphoma cancer cells. Once low-affinity binders are identified, they can be linked together to produce multidentate synthetic high-affinity ligands (SHALs) that have very high specificity for their target protein receptors. An important nanotechnology application for SHALs is their use in the development of robust chemical sensors or biochips for the detection of pathogen proteins in environmental samples or body fluids. Here we describe a recently developed NMR competition assay based on transferred nuclear Overhauser effect spectroscopy that enables the identification of sets of ligands that bind to the same site, or a different site, on the surface of TeNT fragment C (TetC) than a known "marker" ligand, doxorubicin. Using this assay, one can identify the optimal pairs of ligands to be linked together for creating detection reagents, as well as estimate the relative binding constants for ligands competing for the same site.


Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy

NMR spectroscopy has proven to be a powerful technique to study the structure and dynamics of biological macromolecules. Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy is a comprehensive textbook that guides the reader from a basic understanding of the phenomenological properties of magnetic resonance to the application and interpretation of modern multi-dimensional NMR experiments on 15N/13C-labeled proteins. Beginning with elementary quantum mechanics, a set of practical rules is presented and used to describe many commonly employed multi-dimensional, multi-nuclear NMR pulse sequences. A modular analysis of NMR pulse sequence building blocks also provides a basis for understanding and developing novel pulse programs. This text not only covers topics from chemical shift assignment to protein structure refinement, as well as the analysis of protein dynamics and chemical kinetics, but also provides a practical guide to many aspects of modern spectrometer hardware, sample preparation, experimental set-up, and data processing. End of chapter exercises are included to emphasize important concepts. Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy not only offer students a systematic, in-depth, understanding of modern NMR spectroscopy and its application to biomolecular systems, but will also be a useful reference for the experienced investigator.


Future prospects

Isotopic labeling is an essential and versatile tool for NMR structural biology. Creative labeling of NMR-sensitive nuclei ( 13 C, 15 N, and 2 H), combined with strategic exploitation of naturally 100% abundant nuclei such as 19 F and 31 P, can advance the structural biology of many insoluble macromolecules important in biology.

For future progress in solid-state NMR structural biology, it will be important to develop a more diverse panel of isotopically labeled compounds and to produce the existing compounds at a more economical level. Since biosynthetically obtained 13 C-labeled precursors are ubiquitous and relatively simple to produce, one of the future challenges is a chemical one, which is to produce a diverse array of specifically labeled specifically labeled amino acids and other small biomolecules with isotopic labels at desired positions.


Podívejte se na video: TOP 5 Suplemenata Za Dodavanje Misicne Mase (Červenec 2022).


Komentáře:

  1. Marsh

    What necessary words ... Great, a great idea

  2. Sagore

    They are similar to the expert)))

  3. Shaylon

    Agree, a useful piece

  4. Melechan

    I consider, what is it - your error.

  5. Amnchadh

    Omlouvám se, ale podle mého názoru děláte chybu. Napište mi do PM.

  6. Parrish

    Chci říct, že se mýlíš. Vstupte, budeme diskutovat. Napište mi do PM.



Napište zprávu