Informace

Co je to myotuba?

Co je to myotuba?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pokud tomu dobře rozumím, následující obrázky ukazují hlavní součásti lidského kosterního svalu:

Ze života: Věda o biologii:

Z fyziologie člověka/svalového systému ve wikibooks:

Oba zdroje však slovo „myotube“ nezmiňují ani jednou.

Stránka Myogenesis na Wikipedii říká:

Svalová vlákna obecně tvoří fúzi myoblastů do vícejaderných vláken nazývaných myotuby.

Ale nevím, jak tuto větu rozebrat.

Abych se přidal k mému zmatku, hledání „myotube“ na Wikipedii mě přesměruje na stránku Muscle Wikipedie.

Moje otázka tedy zní:
Co je to vlastně myotuba?
Mohl byste na to upozornit na jednom z obrázků výše?


A myotube je typ buňky, ze které se vyvine svalové vlákno. Vzniká fúzí mnohočetných myoblastů, a tím získává mnohočetná buněčná jádra. Jádra jsou uprostřed buňky myotube, na rozdíl od zralého svalového vlákna, kde jsou jádra na okraji buňky. Myotube má trubicovitou formu místo typičtější zaoblené buněčné formy myoblastu. Myotuba začíná s několika nebo žádnými myofibrilami a prochází dlouhým, postupným vývojem, který shromažďuje vlákna, myofibrily a další struktury svalového vlákna. Přechod do zralého svalového vlákna není zřetelný, ale může být definován jako bod, kde všechna jádra migrovala na periferii buňky.

Stručněji, Slovník buněčné a molekulární biologie vstup pro myotube říká:

(biologie) Protáhlé vícejaderné buňky (tři nebo více jader), které obsahují některé periferně umístěné myofibrily.

Vznikají in vivo nebo in vitro fúzí myoblastů a nakonec se vyvinou ve zralá svalová vlákna, která mají periferně umístěná jádra a většinu cytoplazmy vyplněnou myofibrilami. Ve skutečnosti neexistuje příliš jasný rozdíl mezi myotrubicemi a vlastními svalovými vlákny.

Vzhledem k tomu, že diagramy uvedené v otázce jsou pro zralé svaly, nezobrazují myotrubice, ale ukazují jejich výsledek: svalová vlákna.


Myotube je kosterní svalové vlákno vytvořené fúzí myoblastů během vývojové fáze;

několik myofibril se vyskytuje na periferii a centrální jádro je obsazeno jádry a sarkoplazmou, takže vlákno má tubulární vzhled

a máte diagramy.


Signalizace FGF řídí vedení myotube regulací aktivity Rac

Vznikající myotuby procházejí během myogeneze dramatickou morfologickou transformací, při které se myotuby prodlužují přes několik průměrů buněk a jsou směrovány do správných míst svalového připojení. Ačkoli je tento proces vedení myotuborů nezbytný pro vzorování muskuloskeletálního systému, mechanismy, které řídí vedení myotuborů, zůstávají nedostatečně pochopeny. Pomocí transkriptomiky jsme zjistili, že složky signální dráhy fibroblastového růstového faktoru (FGF) byly obohaceny v nascentních myotubech u embryí Drosophila. Nulové mutace v receptoru FGF heartless (htl) nebo jeho ligandech způsobily významné defekty vedení myotube. Ligand FGF Pyramus je v ektodermu exprimován široce a ektopická exprese Pyramusu narušila svalové modelování. Mechanicky Htl reguluje aktivitu Rho/Rac GTPáz v nascentních myotubech a ovlivňuje změny v aktinovém cytoskeletu. Signály FGF jsou tedy základními regulátory vedení myotube, které působí prostřednictvím regulačních proteinů cytoskeletu k modelování pohybového aparátu.


Abstraktní

Trojrozměrné (3D) buněčné modely založené na hydrogelu jsou atraktivní pro bioinženýrství a farmaceutický vývoj, protože se mohou více podobat buněčné funkci přirozené tkáně mimo tělo. Obecně jsou tyto modely složeny z buněk specifických pro tkáň vložených do podpůrného materiálu, jako je hydrogel. Protože vlastnosti hydrogelu přímo ovlivňují funkci buněk, složení hydrogelu je často přizpůsobeno požadovanému typu (typům) buněk a funkčnímu cíli modelu. Zde vyvíjíme parametrickou analýzu a screeningovou metodu pro identifikaci vhodných podmínek zapouzdření pro tvorbu myotubusů z primárních myších myoblastů v hydrogelech methakryloyl želatiny (GelMA). Účinek vlastností matrice na tvorbu myotube byl zkoumán změnou hmotnostních procent GelMA (hmot. %, které řídí modul gelu), hustoty buněk a koncentrace Matrigelu. Kontraktilní myotuby se tvoří prostřednictvím myoblastové fúze a jsou charakterizovány expresí těžkého řetězce myosinu (MyHC). Pro efektivní screening gelových formulací jsme vyvinuli fluorescenční test čtečky destiček pro kvantifikaci barvení MyHC ve vzorcích gelu jako metriku tvorby myotube. Pozorovali jsme, že nižší hmotnostní % GelMA vedlo ke zvýšenému barvení MyHC (tvorba myotube). Hustota buněk významně neovlivnila barvení MyHC, zatímco zahrnutí Matrigelu zvýšilo barvení MyHC, nebyl však pozorován účinek závislý na koncentraci. Tato zjištění byla podpořena pozorováním spontánně kontrahujících myotubulů ve vzorcích vybraných v počátečním screeningu. Tato práce poskytuje metodu rychlého screeningu hydrogelových formulací pro vývoj 3D buněčných modelů a poskytuje konkrétní návod na formulaci gelů pro tvorbu myotube z primárních myších myoblastů ve 3D.


Výsledek

Exprese netrinů a netrinových receptorů v kultivovaných myoblastech

Náš zájem o proteiny repetice Ig/FNIII nás vedl ke zkoumání exprese netrinových receptorů této třídy během myogenní diferenciace in vitro. Western blot analýzy myoblastů C2C12 odhalily jednotnou hladinu neogeninu v buňkách kultivovaných v růstovém médiu (GM) a buňkách přenesených do DM po dobu 4 dnů (obr. 1 A). To kontrastuje s expresí CDO, která byla přechodně up-regulována v průběhu diferenciace (obr. 1 A Kang et al., 1998). Duplicitní bloty sondované protilátkou proti DCC odhalily pouze stopové hladiny tohoto proteinu (nepublikovaná data). F3, myoblastová linie získaná ošetřením 10T1/2 fibroblastů 5-azacytidinem, také exprimovala neogenin za podmínek GM i DM (obr. 1 B). Fibroblasty 10T1/2 a buňky 10T1/2 převedené na myoblasty stabilní expresí MyoD opět exprimovaly nerozlišitelné hladiny neogeninu (obr. 1 C), což je v kontrastu s expresí CDO, která byla indukována MyoD (obr. 1 C Kang et al. , 1998). Nakonec exprese onkogenního Ras v buňkách C2C12, která vede ke snížení MyoD a CDO a blokuje diferenciaci (Kang et al., 1998), neměla žádný vliv na hladiny neogeninu (nepublikovaná data). Tyto výsledky společně ukazují, že neogenin je exprimován v myogenní linii, ale jeho exprese není závislá na myogenních faktorech.

Specifické netriny byly zkoumány podobným způsobem. Netrin-3 byl exprimován v buňkách C2C12 i F3 za GM podmínek a hladiny se zvýšily, když byly buňky přeneseny do DM (obr. 1, A a B). Toto zvýšení bylo také zřejmé na úrovni mRNA, přičemž buňky C2C12 vykazovaly jeden netrin-3 transkript ~7 kb (obr. 1 D). Na rozdíl od toho duplicitní Western a Northern bloty sondované na expresi proteinu netrin-1 a mRNA, v tomto pořadí, neodhalily signál, navzdory schopnosti detekovat přechodně produkovaný netrin-1 (nepublikovaná data). Netrin-3 produkovaný buňkami C2C12 nebyl pozorován v supernatantu kultivačního média (nepublikovaná data), což naznačuje, že podobně jako endogenní netriny-1 a -2 v destičce kuřecího dna a netrin-1 v míše dospělých potkanů ​​je pravděpodobné, že spojené s buněčnými membránami a/nebo ECM (Serafini et al., 1994 Manitt et al., 2001). Buňky 10T1/2 a 10T1/2-MyoD také exprimovaly netrin-3 (obr. 1 C). Dospělo se k závěru, že myoblastové buněčné linie a buňky 10T1/2 exprimují jak netrin-3, tak jeden z jeho receptorů, neogenin, což zvyšuje možnost, že v těchto buňkách může existovat autokrinní signální dráha.

Hladiny neogeninu regulují tvorbu myotube

Abychom posoudili úlohu neogeninu v myogenezi, transfekovali jsme různé „kmeny“ buněk C2C12 a F3 buněk vektorem zkonstruovaným tak, aby řídil expresi cDNA lidského neogeninu a genu rezistence na puromycin. Transfekované kultury byly vybrány a analyzovány na expresi neogeninu. Stabilní nadměrné exprese neogeninu bylo dosaženo pouze u jednoho kmene buněk C2C12. Tyto buňky, dříve popsané námi a označené jako C2C12(E) buňky (Kang et al., 1998), jsou vysoce diferenciační v tom, že: (a) exprimovaly detekovatelný myogenin před přechodem do DM (b) byly méně citlivé k inhibici diferenciace středními hladinami séra (např. 5% FBS) a (c) dokončily proces diferenciace po dobu 2 dnů. Tyto buňky byly použity pro všechny následující experimenty a jsou jednoduše označovány jako buňky C2C12. Neogeninové vektorové transfektanty (C2C12/neogeninové buňky) produkovaly dvakrát až třikrát více neogeninu než kontrolní vektorové transfektanty (C2C12/puro buňky Obr. 2 A). Nadprodukce neogeninu mírně snížila proliferaci buněk C2C12 v GM ve srovnání s vektorovými kontrolami (obr. S1) a nezměnila jejich morfologii v GM (není znázorněno). Při pozorování 24 hodin po přesunutí kultur do média obsahujícího 5 % FBS (doba, kdy byl proces diferenciace ve střední progresi), buňky C2C12/neogenin vytvořily větší myotuby s více jádry než buňky C2C12/puro (obr. 2 B). Kultury C2C12/neogenin vykazovaly zvýšení celkového počtu jader přítomných v buňkách pozitivních na těžký řetězec myosinu (MHC) a průměrného počtu jader/myotube (obr. 2 C). Když byly analyzovány na expresi svalově specifických proteinů, včetně MyoD, myogeninu, MHC a troponinu T (TnT), buňky C2C12/neogenin vykazovaly zrychlenou expresi TnT, ale jinak byly podobné buňkám C2C12/puro (obr. 2 D). Nadměrná exprese neogeninu tedy vedla ke zvýšené tvorbě myotubulů bez dramatických změn v několika biochemických markerech diferenciace.

Pro posouzení účinku snížení hladin neogeninu na tvorbu myotube byl použit přístup RNAi. Sekvence z oblasti kódující myší neogenin byla vložena do vektoru pSilencer a byla kotransfekována expresním vektorem GFP do buněk C2C12, vektor pSilencer bez inzertu byl použit jako kontrola. Transfekované kultury byly tříděny na přítomnost GFP a hodnoceny na snížení hladin neogeninu. Reprezentativní Western blot je ukázán na obr. 3 A. GFP-tříděné buňky, které obdržely neogeninový RNAi vektor produkovaly méně a menší myotuby než tříděné kontrolní transfektanty (obr. S2). Pro přesnější kvantifikaci tohoto účinku byly buňky C2C12 kotransfekovány neogeninovým RNAi vektorem nebo vektorem postrádajícím inzert plus plasmid řídící expresi nlacZ (kódující jaderně lokalizovanou β-galaktosidázu β-gal). O 2 dny později byly kultury přeneseny do 5% FBS na 24 hodin a poté fixovány a dvakrát obarveny na aktivitu MHC a p-gal. Když kontrolní vektor-transfektanty fúzovaly s netransfekovanými buňkami, mnoho (často většina) jader v myotube se stalo pozitivními na β-gal aktivitu, pravděpodobně proto, že cytoplazmaticky translatovaný protein difundoval do myotuby (obr. 3 B). Když byl zaznamenán počet jader v buňkách β-gal +, ∼56% mělo více než pět jader, ∼21% mělo dvě až čtyři jádra a ∼23% mělo jedno jádro (obr. 3 C). Na rozdíl od toho distribuce β-gal + buněk, které obdržely neogeninový RNAi vektor, byla silně vychýlena směrem k buňkám obsahujícím jediné jádro, přičemž pouze asi 5 % vykazovalo více než pět jader (obr. 3 C). Buňky, které obdržely RNAi vektor obsahující neogeninovou sekvenci, která byla neúčinná při snižování hladin neogeninového proteinu, se chovaly ekvivalentně jako buňky, které obdržely vektor bez inzertu (nepublikovaná data).

Jako další test specifičnosti jsme se snažili zachránit defekt buněčné fúze produkovaný neogeninovou RNAi prostřednictvím ektopické exprese cDNA lidského neogeninu. Sekvence RNAi použitá k zacílení endogenního myšího neogeninu není plně konzervovaná v lidské cDNA, a proto by expresní vektor lidského neogeninu měl být nepropustný pro „knockdown“ zprostředkovaný RNAi. Byly studovány tři podmínky: (1) buňky C2C12 kotransfekované pSilencerem postrádajícím RNAi sekvence a kontrolní vektor pro expresi lidského neogeninu (pSil/pBP) (2) buňky kotransfekované pSilencerem obsahujícím neogeninové RNAi sekvence a kontrolní vektor pro expresi lidského neogeninu (RNAi) /pBP) a (3) buňky kotransfekované pSilencerem obsahujícím RNAi sekvence a expresní vektor lidského neogeninu (RNAi/hNeogenin). Z neznámých důvodů transfektanty pSil/pBP reprodukovatelně produkovaly méně myotubusů s více než pěti jádry než buňky, které obdržely pouze kontrolní vektor pSilencer (~30 % vs. ~56 %, v tomto pořadí porovnejte obr. 3 D s obr. 3, C a E). Důležité však je, že transfektanty RNAi/pBP byly silně blokovány před tvorbou myotubu, zatímco transfektanty RNAi/hNeogenin se velmi podobaly kontrolním kulturám pSil/pBP (obr. 3, D a E). Vynucená exprese neogeninu tedy zachránila účinky RNAi na neogenin, což dále ukazuje, že účinky RNAi byly specifické. Dochází k závěru, že snížení hladin neogeninu snížilo schopnost myoblastů podílet se na tvorbě myotub. Společně s údaji o nadměrné expresi na obr. 2 tyto výsledky silně naznačují, že hladiny neogeninu jsou pro tento aspekt myogeneze C2C12 rychlostně omezující.

Rekombinantní netrin podporuje tvorbu myotube

Abychom vyhodnotili účinky netrinu-3 na myoblastové buněčné linie, nejprve jsme se pokusili syntetizovat rekombinantní myší protein v buňkách COS a 293T, ale podobně jako v případě Puschela (1999) jsme nebyli schopni produkovat dostatečné množství vylučovaného rozpustného materiálu. Myší netrin-3 je ortologní vůči lidskému netrinu-2L, a přestože není ortologní vůči kuřecímu netrinu-2, je seskupen s oběma těmito proteiny pomocí dendrogramových analýz v podkategorii označené jako „netrin-2-like“, odlišitelné od „netrinu“. -1–like“ skupina (Puschel, 1999). Proto jsme se pro tuto práci rozhodli použít rekombinantní kuřecí netrin-2, protože je komerčně dostupný. Buňky C2C12 byly kultivovány v GM, poté přeneseny do 5% FBS plus nebo mínus kuřecí netrin-2 a pozorovány o 24 hodin později. Proliferace buněk C2C12 nebyla ovlivněna ošetřením netrinem-2 (obr. S3). Ačkoli však kontrolní kultury za těchto podmínek vykazovaly malé myotuby MHC +, kultury ošetřené netrinem-2 vykazovaly zřetelně větší myotuby se zvýšením celkového počtu jader v buňkách MHC + a průměrného počtu jader/myotrubice (obr. 4, A a B). Při analýze exprese proteinů specifických pro svaly buňky, které obdržely netrin-2, produkovaly významně více TnT než kontrolní buňky, ale hladiny MyoD, myogeninu, MHC a CDO byly nezměněny (obr. 4 C). Podobně jako nadměrná exprese neogeninu vedla léčba buněk C2C12 neogeninovým ligandem ke zvýšené tvorbě myotube a změnám v expresi TnT, ale ne k několika dalším svalovým markerům.

Aby se zjistilo, zda netrin-2 uplatňuje své účinky na tvorbu myotube způsobem závislým na neogeninu, byl generován buněčný derivát C2C12, který stabilně exprimoval vektor neogeninu RNAi, tyto buňky exprimovaly podstatně méně neogeninu než kontrolní transfektanty a produkovaly stále menší množství myotubes než kontrolní transfektanty při posunu na DME/5% FBS na 24 h (obr. 5, A – C). Když byly kontrolní buňky ošetřeny netrinem-2 za těchto podmínek, chovaly se podobně jako rodičovské buňky C2C12 a tvořily větší myotuby s více jádry. Naproti tomu buňky exprimující neogenin RNAi nebyly netrinem-2 ovlivněny (obr. 5, B a C). Proto se dospělo k závěru, že schopnost netrinu-2 podporovat tvorbu myotubu buňkami C2C12 závisí na netrinovém receptoru, neogeninu.

Neogenin aktivuje myogenní bHLH faktor- a NFAT-dependentní reportérové ​​konstrukty

Signály CDO pro posílení transkripce závislé na myogenním faktoru bHLH (Cole et al., 2004) a signály netrin-1 prostřednictvím DCC ke stimulaci transkripce zprostředkované NFAT (Graef et al., 2003). Proto jsme hodnotili, zda by neogenin mohl stimulovat reportérové ​​konstrukty specifické pro myogenní bHLH faktory a NFAT. V přechodných testech buněk C2C12 kotransfekce neogeninového expresního vektoru zesílila aktivitu reportérového konstruktu řízeného čtyřmi opakovanými myogenními E-boxy (4Rtk-luc), přibližně třikrát více než u kontrolního vektoru bez cDNA inzertu (obr. 6). A). Kotransfekce fibroblastů 10T1/2 expresními vektory pro MyoD a jeho heterodimerního partnera E12 vedla k aktivaci 4Rtk-luc a tato aktivita byla také přibližně trojnásobně zvýšena koexpresí neogeninu (obr. 6 B). Neogenin však nemohl aktivovat reportér v nepřítomnosti MyoD (nepublikovaná data).

Kotransfekce neogeninového expresního vektoru do buněk C2C12 nebo 10T1/2 zvýšila aktivitu reportéru NFAT-luciferázy přibližně dvojnásobně, na rozdíl od toho expresní vektor CDO neměl žádný účinek na transkripci závislou na NFAT (obr. 6, C a D). Z různých izoforem NFATc zapojených do myogeneze je pouze NFATc3 aktivován v diferencujících myoblastech C2C12 (Delling et al., 2000). Pro posouzení, zda signalizace netrin-neogenin může aktivovat NFATc3, byly buňky C2C12 a 10T1/2 ošetřeny rekombinantním kuřecím netrinem-2 po dobu 6 nebo 30 hodin. Imunobloty testované protilátkou specifickou pro NFATc3 odhalily zvýšené hladiny NFATc3 po 6 hodinách léčby netrinem-2, včetně rychleji migrující formy, která pravděpodobně představuje defosforylovaný, aktivovaný NFATc3 (obr. 6 E). Tato odpověď se během 30 hodin vrátila na výchozí hodnotu nebo nižší. V souladu s tímto relativně krátkým trváním účinku zvýšilo přidání netrinu-2 ke kontrolním kulturám nebo kulturám transfekovaným neogeninem aktivitu reportéru NFAT-luciferázy pouze o ~40 % v každém případě (nepublikovaná data).

Pro posouzení, zda byly účinky netrinu-2 na NFATc3 závislé na neogeninu, byly buňky C2C12 přechodně transfekovány neogeninovou RNAi nebo kontrolními vektory plus expresním vektorem GFP, tříděny a ošetřeny médiem obsahujícím 5 % FBS plus nebo minus netrin-2 . Ošetření kontrolních transfektantů Netrinem-2 vedlo ke zvýšeným hladinám NFATc3, podobně jako u rodičovských buněk C2C12, naproti tomu transfektanty neogenin RNAi nereagovaly na netrin-2 (obr. 6 F). Derivát C2C12, který stabilně exprimoval neogenin RNAi (obr. 5), vykazoval podobnou absenci odpovědi (obr. 6 G). Jak je tedy patrné se zvýšením tvorby myotube, netrin-2 vyžadoval neogenin, aby uplatnil své účinky na hladiny NFATc3.

Neogenin tvoří komplex s CDO

Proteiny Ig/FNIII se mohou vázat cis způsobem na další členy této rodiny za vzniku komplexů, které regulují jejich funkci. Například Robo receptory se vážou na DCC, aby umlčely přitažlivost zprostředkovanou netrinem-1 (Stein a Tessier-Lavigne, 2001), a BOC váže CDO, aby stimuloval myogenezi (Kang et al., 2002).Aby se otestovalo, zda by neogenin mohl také interagovat s CDO, byly lyzáty z buněk C2C12 a F3 imunoprecipitovány protilátkami proti CDO nebo neogeninu a blotovány reciproční protilátkou. Neogenin byl přítomen v imunoprecipitátech CDO a CDO v imunoprecipitátech neogeninu z obou buněčných linií, což naznačuje, že tyto dva proteiny skutečně tvoří komplex (obr. 7, A a B). Více neogeninu koimunoprecipitovalo s CDO za DM než za GM podmínek, ačkoli tato zvýšená asociace u DM nebyla evidentní v reciproční koimunoprecipitaci (obr. 7, A a B). Současná imunoprecipitace neogeninu a CDO se nezmenšila, když byly buňky C2C12 shromážděny jako jednobuněčná suspenze v přítomnosti EDTA (která blokuje kadherinem zprostředkovanou adhezi), což naznačuje, že k interakci dochází cis způsobem (obr. 7 C). . CDO asociuje s N- a M-kadheriny v myoblastech (Kang et al., 2003) a kadheriny také koimunoprecipitované s neogeninem (obr. 7 B), což naznačuje, že tyto proteiny mohou spolu interagovat ve struktuře vyššího řádu. Kromě toho, v souladu s tím, že netrin-3 funguje jako neogeninový ligand v buňkách C2C12, byl také pozorován v imunoprecipitátech neogeninu (obr. 7 B).

Pro podrobnější zkoumání tvorby komplexu mezi CDO a neogeninem byly provedeny přechodné transfekce v buňkách 293T. Neogenin byl snížen pomocí protilátek proti CDO, když byl CDO koexprimován, ale nikoli, když byl analogicky vynechán CDO, CDO byl snížen neogeninovými protilátkami způsobem závislým na neogeninu (obr. 7, D a E). Jak je vidět u buněk C2C12, sběr přechodně transfekovaných buněk 293T ve formě jednobuněčné suspenze v EDTA nesnížil asociaci mezi neogeninem a CDO (obr. 7 F). Navíc, když byly 293T transfektanty, které exprimovaly pouze CDO, společně kultivovány s transfektanty, které exprimovaly pouze neogenin, imunoprecipitace obou proteinů nedokázala koprecipitovat ten druhý, očekávalo se, že interakce bude pozorována, pokud k vazbě dojde trans způsobem (nepublikovaná data). Údaje o přechodné expresi společně: (a) stanoví specifičnost protilátek (b) potvrzují cis povahu asociace CDO-neogenin a (c) naznačují, že k tomu pravděpodobně nebudou zapotřebí další faktory specifické pro buněčný typ. interakce.

CDO obsahuje ektodoménu složenou z pěti Ig a tří repetic FNIII, jednoprůchodovou transmembránovou oblast a cytoplazmatický konec o 270 aminokyselinách (Kang et al., 1997). K identifikaci oblastí CDO zapojených do tvorby komplexu s neogeninem byla testována řada CDO delečních mutantů, které postrádají každé jednotlivé opakování Ig a FNIII, na jejich schopnost společně imunoprecipitovat neogenin. Buňky 293T byly přechodně transfekovány expresními vektory pro neogenin a buď CDO divokého typu nebo individuální mutanty CDO (označené symbolem „A“ následovaným odstraněnou doménou). Buněčné lyzáty byly precipitovány protilátkami proti intracelulární oblasti CDO a imunoprecipitáty byly blotovány a sondovány protilátkami proti neogeninu nebo CDO (obr. 7 G). CDO mutanty ΔIgl a ΔFN2 byly deficientní (i když ne zcela defektní) ve své schopnosti asociovat se s neogeninem ve srovnání s CDO plné délky. Naproti tomu ΔIg2, ΔIg4, ΔIg5 a ΔFN1 nevykazovaly žádné významné snížení této vlastnosti. ΔFN3 poskytl poněkud variabilní výsledky v průběhu mnoha experimentů, což naznačuje, že se může podílet na vazbě neogeninu, ale není tak důležitý jako Ig1 nebo FN2. Delece Ig repetice 3 zjevně vedla k destabilizaci CDO, protože byla pozorována pouze velmi slabá exprese tohoto proteinu. Konstrukt, ve kterém byla signální sekvence CDO napojena přímo na její transmembránové a cytoplazmatické oblasti (označené jako CDO(TMintra) Kang et al., 2002), byl odstraněn v imunoprecipitátech neogeninu, i když neefektivně, což naznačuje, že intracelulární oblasti CDO a neogeninu mohou také přidružit (nepublikované údaje). Výsledky na obr. 7 jsou společně v souladu se závěrem, že neogenin a CDO tvoří komplexy v cis a že tato interakce je závislá na přítomnosti specifických repetic v ektodoméně CDO. Navzdory své sekvenční podobnosti s neogeninem a schopnosti interagovat s neogeninem se CDO nezdá být nezávislým netrinovým receptorem, protože nebyl schopen vázat fúzní protein netrin-1-Fc za podmínek, ve kterých ano. Kromě toho BOC také nebyl schopen vázat netrin-1-Fc a nezdá se, že by koexprese CDO a/nebo BOC měnila vazbu netrin-1-Fc na neogenin (nepublikovaná data).

Abychom získali přehled o tom, zda je schopnost neogeninu vázat se na CDO důležitá pro signalizaci netrin-neogenin, primární myoblasty odvozené od myší divokého typu a myší homozygotních pro cílenou mutaci Cdo byly analyzovány na jejich odpověď na rekombinantní kuřecí netrin-2. Cdo + / + a Cdo/ − myoblasty exprimují podobné úrovně MyoD, ale během diferenciace Cdo/ − buňky produkují nižší hladiny myogeninu a tvoří myotuby velmi neefektivně (Cole et al., 2004). Stejně jako myoblastové buněčné linie exprimovaly primární myoblasty netrin-3 a neogenin, bez ohledu na jejich Cdo genotyp (obr. 8 A). Před léčbou netrinem-2 Cdo + / + a Cdo/ - myoblasty byly podobné v tom, že každý exprimoval poněkud vyšší hladiny pomaleji migrující formy NFATc3 než rychleji migrující, pravděpodobně aktivovaná forma (obr. 8 B). Po 3 hodinách expozice netrinu-2, Cdo + / + buňky vykazovaly výrazný posun k rychleji migrující formě, což je v souladu s aktivací signalizace NFAT na rozdíl od Cdo/ − myoblasty nevykazovaly žádnou odpověď a poměr dvou forem NFATc3 se podobal poměru pozorovanému u neošetřených buněk (obr. 8 B). Ztráta CDO tedy vedla ke ztrátě schopnosti reagovat na netrin-2 navzdory přítomnosti normálních hladin jeho receptoru, což naznačuje, že interakce neogeninu s CDO je důležitá pro signalizaci touto cestou.


Chování modelu? Myotubes a hledání ex vivo modelu svalu

Pochopení toho, jak svaly fungují, je důležité, ale pitvat svalová vlákna od lidí je obtížné, mohly by být alternativní možností myotrubice? Výzkum publikovaný v Kosterní sval vyšetřuje to a zde Jennifer Levy vysvětluje více.

Jako mnoho věcí v životě, i biologické experimenty vyžadují rovnováhu. Výzkumník musí vyvážit snadnost experimentu a relevanci výsledku. Jak se výzkumník stává více redukcionistickým ve svém experimentálním designu, experiment se stává proveditelnějším.

Například nefrolog by mohl navrhnout studii funkce ledvin v modelovém organismu, v izolovaných ledvinách nebo v linii ledvinových buněk pěstovaných v Petriho misce. Ve skutečnosti může dokonce studovat určité reakce v purifikovaných proteinech in vitro.

S každým z těchto omezení však, jak se zvyšuje snadnost (menší velikosti, méně komplikujících faktorů, menší variabilita), stává se fyziologický dopad výsledku spletitější. Chovají se kultivované ledvinové buňky úplně stejně jako ledvinové buňky ve fungující ledvině? Určitě ne.

Nedávný Kosterní sval rukopis Olsson et al. konfrontuje problém snadnosti versus relevance ve svalových vláknech. Funkční jednotkou lidského kosterního svalstva je svalové vlákno. Výzkumníci se mohou naučit cenné lekce o svalové biologii a nemocech studiem svalových vláken izolovaných od pacientů s muskuloskeletálními chorobami, stejně jako zdravých kontrol.

Diferencované myotuby

Neporušená svalová vlákna lze z lidí vypreparovat, ale tato technika je obtížná, často vede k velmi malému počtu životaschopných vláken. Zatímco jen několik životaschopných vláken může být použitelných pro určité techniky (zobrazování nebo studie uchycení náplastí), jiné (jako je biochemie) vyžadují větší počet buněk.

Proto vědci izolují svalové prekurzorové buňky z biopsií a poté je v kultivačních miskách diferencují na myotuby. Tyto myotubes slouží jako model pro lidský dospělý kosterní sval. Myotubes vypadají velmi podobně jako izolovaná svalová vlákna – obě jsou prodloužené, vícejaderné a kontrahují se po elektrické stimulaci. Z těchto důvodů se diferencované myotuby staly běžně používaným nástrojem pro studium mnoha molekulárních a fyziologických vlastností svalů.

Význam vápníku

Olsson a kol. rozhodli se přímo porovnat přechody vápníku a následné kontrakce pozorované v myotubech s těmi pozorovanými ve svalových vláknech.

Regulace intracelulárního vápníku je zásadní pro funkci kosterního svalstva. Globální vlna vápníku, která zaplavuje svalovou buňku v reakci na depolarizaci membrány (aka „kalcium transient“), působí tak, že spojuje depolarizaci povrchové membrány se svalovou kontrakcí.

A vnitřní rychlost přechodu vápníku je zase modulována přítomností a lokalizací proteinů manipulujících s vápníkem. Olsson a kol. rozhodli se přímo porovnat přechody vápníku a následné kontrakce pozorované v myotubech s těmi pozorovanými ve svalových vláknech.

Našli mezi nimi výrazné rozdíly. Po elektrické stimulaci téměř všechna neporušená svalová vlákna vykazovala přechodné zvýšení vápníku a kontrakce vyvolávající sílu, zatímco pouze asi 50 % myotubulů vykazovalo podobné přechodné zvýšení vápníku po stimulaci.

Kinetika těchto zvýšení byla dále změněna a nebyla vždy doprovázena kontrakcemi myotube. Důvod tohoto spouštěcího selhání je jasný, když autoři dále ukazují, že myotrubice postrádají uspořádání aktinových a myosinových filamentů nezbytných pro kontrakce. Ve srovnání se svalovými vlákny je navíc řada důležitých proteinů manipulujících s vápníkem downregulována nebo mislokalizována v myotubech.

Co mohou výzkumníci dělat?

Existuje něco, co může výzkumník udělat, aby povzbudil myotubu, aby byla více podobná vláknu? Autoři aktuální studie to neřeší experimentálně, ale předchozí práce od Tanaky a kol. ukazují, že lidské svalové buňky, které byly inervovány společnou kultivací s krysí míchou, vykazovaly kontinuální kontrakci a rozsáhlé křížové proužky podobné neporušeným svalovým vláknům. Inervace je pravděpodobně klíčem k tomu, aby se myotube více podobala svalovému vláknu.

Celkově tyto výsledky poskytují varovný příběh pro výzkumníky svalů.

Pro výzkumníky, kteří se zajímají o funkční studie lidských svalových vláken, bude vyžadována inovace. Olsson a kol. demonstrují přiměřený úspěch při izolaci vláken z biopsií mezižeberních svalů získaných během torakotomie. Mezižeberní svaly jsou zvláště přístupné izolaci vláken kvůli relativně krátkým délkám vláken (0,5 – 1 cm). Biopsie ze svalů obsahujících delší vlákna (například svaly končetin, které mohou mít až 30 cm) bude pravděpodobně obtížné přizpůsobit se této technice.

Celkově tyto výsledky poskytují varovný příběh pro svalové výzkumníky: myotuby nejsou adekvátním modelem dospělých svalových vláken při studiu podrobností procesů závislých na vápníku. Budoucí studie by pravděpodobně mohly ukázat výrazné rozdíly mezi myotubes a svalovými vlákny v dalších buněčných procesech.


Engel, A. G. & Fanzine-Armstrong, C. Myologie 1937 (McGraw-Hill, New York, 1994).

Renganathan, M., Messi, M. L., Schwartz, R. & Delbono, O. FEBS Lett. 417, 13–16 (1997).

Adams, G. R. & Haddad, F. J. Appl. Physiol. 81, 2509–2516 (1996).

Goldspink, G. J. Anat. 194, 323–334 (1999).

Florini, J.R., Ewton, D.Z. & Coolican, S.A. Endokr. Rev. 17, 481–517 (1996).

Musaro, A., McCullagh, K.J., Naya, F.J., Olson, E.N. & Rosenthal, N. Příroda 400, 581–585 (1999).

Semsarian, C., Sutrave, P., Richmond, D. R. & Graham, R. M. Biochem. J. 339, 443–451 (1999).

Rommel, C. a kol. Věda 286, 1738–1741 (1999).

Friday, B. B., Horsley, V. & Pavlath, G. K. J. Cell Biol. 149, 657–666 (2000).

Dudek, H. a kol. Věda 275, 661–665 (1997).

Svegliati-Baroni, G. a kol. Hepatologie 29, 1743–1751 (1999).

Yu, H. & Berkel, H. J. LA State Med. Soc. 151, 218–223 (1999).

Olson, E.N. & Williams, R.S. Buňka 101, 689–692 (2000).

Wesselborg, S., Fruman, D.A., Sagoo, J.K., Bierer, B.E. & Burakoff, S.J. J. Biol. Chem. 271, 1274–1277 (1996).

Eves, E. M. a kol. Mol. Buňka. Biol. 18, 2143–2152 (1998).

Aman, M. J., Lamkin, T. D., Okada, H., Kurosaki, T. & amp Ravichandran, K. S. J. Biol. Chem. 273, 33922–33928 (1998).

Carver, D. J., Aman, M. J. & amp Ravichandran, K. S. Krev 96, 1449–1456 (2000).

Liu, Q. a kol. Genes Dev. 13, 786–791 (1999).

Jacob, A., Cooney, D., Tridandapani, S., Kelley, T. & Coggeshall, K. M. J. Biol. Chem. 274, 13704–13710 (1999).

Bohni, R. a kol. Buňka 97, 865–875 (1999).

Huang, H. a kol. Rozvoj 126, 5365–5372 (1999).

Leevers, S. J., Weinkove, D., MacDougall, L. K., Hafen, E. & Waterfield, M. D. EMBO J. 15, 6584–6594 (1996).

Montagne, J. a kol. Věda 285, 2126–2129 (1999).

Bodine, S. C. a kol. Nature Cell Biol. 3, 1014–1019 (2001).

Glass, D. J. a kol. Studený jarní Harb. Symp. Kvant. Biol. 57, 53–62 (1992).

Azpiazu, I., Saltiel, A. R., DePaoli-Roach, A. A. & Lawrence, J. C. J. Biol. Chem. 271, 5033–5039 (1996).


Předmětové oblasti ASJC Scopus

  • APA
  • Autor
  • BIBTEX
  • Harvard
  • Standard
  • RIS
  • Vancouver

In: Journal of Cell Biology , Vol. 169, č. 2, 25.04.2005, s. 257-268.

Výstup výzkumu : Příspěvek do časopisu › Článek › peer-review

T1 - Specifikace transkripční regulace osudu myotube a intrafusální morfogeneze svalových vláken

AU - Tourtellotte, Warren G.

N2 - Receptory natažení svalového vřeténka obratlovců jsou důležité pro pocit polohy končetiny (propriocepci) a reflexy natažení. Strukturálně komplexní napínací receptor vzniká z jediné myotuby, která je transformována na mnohočetná intrafuzální svalová vlákna senzorickou transdukcí signálu závislou na axonech, která mění genovou expresi v kontaktovaných myotubách. Senzoricky odvozené dráhy přenosu signálu, které specifikují osud myotubulů, jsou velmi špatně pochopeny. Transkripční faktor se zinkovým prstem, gen časné růstové odpovědi 3 (Egr3), je selektivně exprimován ve senzorických myotubech kontaktovaných s axony a je nezbytný pro normální intrafuzální diferenciaci svalových vláken a vývoj vřeténka. Zde ukazujeme, že nadměrná exprese Egr3 v primárních myotubech in vitro vede k expresi konkrétního repertoáru genů, z nichž některé prokazujeme, jsou také regulovány Egr3 při vývoji intrafuzálních svalových vláken ve vřetenech. Naše výsledky tedy identifikují síť genů, které jsou regulovány Egr3 a podílejí se na diferenciaci intrafuzálních svalových vláken. Kromě toho jsme ukázali, že Egr3 zprostředkovává specifikaci osudu myotube, která je indukována senzorickou inervací, protože kosterní myotuby, které exprimují Egr3 nezávisle na jiné regulaci senzorických axonů, jsou transformovány do svalových vláken se strukturní a molekulární podobností s intrafuzálními svalovými vlákny. Egr3 je tedy cílový gen, který je regulován senzorickou inervací a který zprostředkovává genovou expresi podílející se na specifikaci osudu myotube a morfogenezi intrafusálních svalových vláken.

AB - Receptory natažení svalového vřeténka obratlovců jsou důležité pro vnímání polohy končetin (propriocepce) a reflexy natahování. Strukturálně komplexní napínací receptor vzniká z jediné myotuby, která je transformována na mnohočetná intrafuzální svalová vlákna senzorickou transdukcí signálu závislou na axonech, která mění genovou expresi v kontaktovaných myotubách. Senzoricky odvozené dráhy přenosu signálu, které specifikují osud myotubulů, jsou velmi špatně pochopeny. Transkripční faktor se zinkovým prstem, gen časné růstové odpovědi 3 (Egr3), je selektivně exprimován ve senzorických myotubech kontaktovaných s axony a je nezbytný pro normální intrafuzální diferenciaci svalových vláken a vývoj vřeténka. Zde ukazujeme, že nadměrná exprese Egr3 v primárních myotubech in vitro vede k expresi konkrétního repertoáru genů, z nichž některé jsou také regulovány Egr3 při vývoji intrafuzálních svalových vláken ve vřeténech. Naše výsledky tedy identifikují síť genů, které jsou regulovány Egr3 a podílejí se na diferenciaci intrafuzálních svalových vláken. Kromě toho jsme ukázali, že Egr3 zprostředkovává specifikaci osudu myotube, která je indukována senzorickou inervací, protože kosterní myotuby, které exprimují Egr3 nezávisle na jiné regulaci senzorických axonů, jsou transformovány do svalových vláken se strukturní a molekulární podobností s intrafuzálními svalovými vlákny. Egr3 je tedy cílový gen, který je regulován senzorickou inervací a který zprostředkovává genovou expresi podílející se na specifikaci osudu myotube a morfogenezi intrafusálních svalových vláken.


Co je myotube? - Biologie

Katedra počítačové biologie a lékařských věd, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo

Laboratoř výpočetní biologie, Graduate School of Biological Sciences, Nara Institute of Science and Technology Katedra biologických věd, Graduate School of Science, University of Tokyo

Katedra biologických věd, Graduate School of Science, University of Tokyo

Katedra biologických věd, Graduate School of Science, University of Tokyo Department of Engineering Science, Graduate School of Informatics and Engineering, University of Electro-Communications

Katedra biologických věd, Graduate School of Science, University of Tokyo

Katedra funkční biologie, Graduate School of Biostudies, Kyoto University

Katedra aplikované chemie, Graduate School of Engineering, University of Tokyo

Katedra počítačové biologie a lékařských věd, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo Katedra biologických věd, Graduate School of Science, University of Tokyo CREST, Japan Science and Technology Corporation

2018 Ročník 43 Číslo 2 Stránky 153-169

  • Zveřejněno: 2018 Přijato: 24. dubna 2018 Vydáno dne J-STAGE: 31. srpna 2018 Přijato: 6. července 2018 Předběžná online publikace: 26. července 2018 Přepracováno: -

(kompatibilní s EndNote, Reference Manager, ProCite, RefWorks)

(kompatibilní s BibDesk, LaTeX)

Automatická segmentace buněk je účinná metoda pro kvantifikaci dynamiky signalizace při rozlišení jedné buňky při fluorescenčním zobrazování živých buněk. Rozsáhle byly vyvinuty metody segmentace pro mononukleární a kruhové buňky. Nicméně metoda segmentace pro prodloužené polynukleární buňky, jako jsou diferencované myotuby C2C12, musí být ještě vyvinuta. Kromě toho jsou myotuby obklopeny nediferencovanými rezervními buňkami, což ztěžuje identifikaci oblastí pozadí a následnou kvantifikaci. Zde jsme vyvinuli metodu automatické kvantitativní segmentace pro myotuby pomocí segmentace povodí sčítaných binárních obrazů a dvousložkového modelu Gaussovy směsi. Použili jsme časosběrné fluorescenční snímky diferencovaných C2C12 buněk stabilně exprimujících Eevee-S6K, biosenzor fluorescenčního rezonančního přenosu energie (FRET) kinázy S6 (S6K). Souhrn binárních obrazů zlepšil kontrast mezi myotubes a rezervními buňkami, což umožnilo detekci myotube a centra myotube. Pomocí centra myotube místo jádra mohly být jednotlivé myotubes automaticky detekovány segmentací povodí. Korekce pozadí pomocí dvousložkového modelu Gaussovy směsi navíc umožnila automatickou kvantifikaci intenzity signálu v jednotlivých myotubech. Poskytujeme tedy metodu automatické kvantitativní segmentace kombinací automatické detekce myotube a korekce pozadí.Kromě toho nám tato metoda umožnila kvantifikovat aktivitu S6K v jednotlivých myotubech, což dokazuje, že některé časové vlastnosti aktivity S6K, jako je doba vrcholu a poločas adaptace, vykazují různé změny inzulinu závislé na dávce mezi buněčnou populací a jednotlivci.

Klíčová slova: časosběrné snímky, buněčná segmentace, fluorescenční rezonanční přenos energie, C2C12, myotube

Fluorescenční zobrazování živých buněk poskytuje výhodu pozorování funkce biologického systému s časoprostorovým rozlišením. S nedávným pokrokem v zobrazovacích technikách a fluorescenčních biosenzorech se ukázalo, že variabilita v intracelulárních stavech vyvolává heterogenitu v dynamickém chování jednotlivých buněk vystavených jednotnému stimulu (Hughey a kol., 2015 Snijder a Pelkmans, 2011 Tomida a kol., 2015 Yao a kol., 2016). Jednobuněčné studie proto odhalily důležitost porozumění buněčné dynamice a heterogenitě.

Pro jednobuněčné studie existuje značná potřeba vyvinout algoritmy, které umožní automatickou segmentaci a kvantifikaci intenzity signálu v jednotlivých buňkách z velkého počtu časosběrných snímků. Metody automatické segmentace byly dosud vyvinuty především pro kulaté a mononukleární buňky (Bajcsy a kol., 2015 Kodiha a kol.(2011). Například segmentace povodí založená na markerech je široce studována a používána pro účinnou segmentaci buněk (Chalfoun a kol., 2014 Hodneland a kol., 2016 Wong a kol., 2010). Typické použití segmentace povodí je zaplavit oblast z obarvených jader jako počáteční zdroj zaplavení, dokud se nedotkne sousedů nebo buněčných hranic. Takovou metodu, která vyžaduje jádro jako marker, však nelze přímo použít pro polynukleární buňky, jako jsou diferencované myotuby C2C12.

Buňky C2C12, odvozené z myších myoblastů, byly použity jako modelové buněčné linie pro studium buněčné diferenciace a svalových funkcí in vitro (Fodor a kol., 2017 Rahar a kol., 2018 Rapid a kol., 2008 Soltow a kol., 2013). Diferenciační indukcí buněk C2C12 tvoří velká subpopulace myoblastů prodloužené polynukleární myotuby, zatímco subpopulace buněk, nazývaná rezervní buňky, zůstává nediferencovaná (obr. 1) (Yoshida a kol., 1998). V kombinaci s heterogenitou v buněčné populaci, prodloužená polynukleární forma myotubulů ztěžuje provádění automatické kvantitativní segmentace jednotlivých myotubu pomocí konvenčních metod vyvinutých pro kulaté tvary a mononukleární buňky bez heterogenní buněčné populace. Vlastnost prodloužené polynukleární formy myotubulů vede k nadměrné segmentaci přímým použitím segmentace povodí. Kromě toho rezervní buňky, které zabírají prostory mezi myotubi, ztěžují automatickou identifikaci oblastí pozadí.

Diferencované myotubes C2C12 stabilně exprimující Eevee-S6K. Diferencované buňky C2C12 stabilně exprimující Eevee-S6K (žlutá). Jádra byla obarvena DAPI (modrá). Protože myotuby jsou mnohem tlustší než rezervované buňky, byly myotuby (červené šipky) mnohem jasnější než rezervní buňky (zelené šipky). Kvůli relativně slabšímu fluorescenčnímu signálu v rezervních buňkách byly viditelné pouze nukleární signály, ale ne signály buněčného těla.

Zde jsme vyvinuli metodu automatické kvantitativní segmentace myotube pomocí segmentace povodí sečtených binárních obrazů a dvousložkového modelu Gaussovy směsi (GMM). Vytvořili jsme buněčnou linii C2C12, která stabilně exprimovala Eevee-S6K, biosenzor fluorescenčního rezonančního přenosu energie (FRET), který monitoruje aktivitu kinázy S6 (S6K), a získali časosběrné fluorescenční obrazy azurového fluorescenčního proteinu (CFP) a FRET- indukoval žlutý fluorescenční protein (FRET-YFP) v diferencovaných myotubech C2C12 (Aoki a Matsuda, 2009). Každý obrázek FRET-YFP jsme vytvořili binárně a sečetli obrázky. Tento postup vedl ke zvýšenému kontrastu mezi myotubi a rezervními buňkami, čímž umožnil selektivní detekci myotubulů. Kromě toho jsme k identifikaci jednotlivých myotubusů použili jako marker jednotlivých myotube spíše centrum myotube než jádro. Abychom identifikovali centrum myotube, použili jsme distanční transformaci na binární obrazy FRET-YFP. Transformace vzdálenosti je operace, která převádí binární obraz na obraz mapy vzdálenosti, kde všechny pixely mají hodnotu odpovídající euklidovské vzdálenosti k nejbližšímu hraničnímu pixelu (Leymarie a Levine, 1992). Vytvořili jsme obrázky binární mapy vzdálenosti a sečetli obrázky, což umožnilo vylepšení center myotube. Pomocí centra myotube místo jádra byly jednotlivé myotuby segmentovány automaticky segmentací povodí.

Odstranění šumového signálu z oblastí pozadí je základním předpokladem pro získání kvantitativních měření. Je však obtížné identifikovat oblasti pozadí kvůli přítomnosti rezervních buněk, které zabírají prostory mezi myotubami. Použili jsme dvousložkový GMM, který odpovídal histogramu intenzity fluorescence a odhadované intenzitě pozadí bez ručního výběru oblastí pozadí. Použití dvousložkového GMM zajišťuje kvantitativní a objektivní měření intenzity signálu.

V této studii tedy poskytujeme rámec pro automatickou kvantitativní segmentaci jednotlivých myotube, která kombinuje segmentaci povodí pomocí automatické segmentace myotube a korekce pozadí. Kromě toho nám tato metoda umožnila kvantifikovat aktivitu S6K v jednotlivých myotubech, což dokazuje, že některé časové vlastnosti aktivity S6K, jako je doba vrcholu a poločas adaptace, vykazují různé změny inzulinu závislé na dávce mezi buněčnou populací a jednotlivci.

Automatická kvantitativní segmentace prodloužených polynukleárních myotubes pomocí časosběrných snímků

Vyvinuli jsme metodu automatické kvantitativní segmentace myotube z fluorescenčních časosběrných snímků diferencovaných buněk C2C12 stabilně exprimujících Eevee-S6K (Aoki a Matsuda, 2009). Metoda automatické kvantitativní segmentace se skládá ze tří kroků, Krok I, II a III. Krok I je předzpracování, kde použití mediánového filtru a bílého cylindrického filtru snižuje kolísání intenzity fluorescence snímků. Krok II je segmentace myotube, kde použití součtových binárních časosběrných snímků posiluje myotuby a centra myotube spíše než rezervní buňky. Krok III je korekce pozadí, kde jsme použili dvousložkový GMM, který odpovídal histogramu intenzity fluorescence a odhadované střední intenzity pozadí bez ručního výběru oblastí pozadí. Parametry použité v jednotlivých krocích byly shrnuty v tabulce I.

Parametr Hodnota (pixel) Popis
střední filtr a 5 délka strany filtračního okna
bílý cylindr b 35 délka strany filtračního okna
bílý cylindr c 30 délka strany filtračního okna
velikost prahu d 10000 prahová oblast myotube

(a) je společná hodnota pro detekci myotubes a detekci center myotube. b) se používá k detekci myotubes. c) se používá k detekci center myotube. d) se používá po segmentaci povodí.

Krok I: Předběžné zpracování časosběrných snímků

Diferencované buňky C2C12 jsou polynukleární a mají protáhlý tvar. Oblast myotube na získaném obrázku proto vykazuje nerovnoměrnou distribuci fluorescence. Pro správnou segmentaci myotubes je nezbytné vyhlazení získaných obrázků. Nejprve jsme použili střední filtr k odstranění odlehlých hodnot (Huang a kol., 1979) a poté aplikovali bílý cylindrický filtr ke snížení kolísání intenzity fluorescence (obr. 2).

Předzpracování fluorescenčních snímků. V kroku I-i jsme aplikovali střední filtr s čtvercovým oknem 5×5 na nezpracované časosběrné snímky FRET-YEP. V kroku I-ii jsme aplikovali bílý cylindr na snímky zpracované mediánovým filtrem. Filtrační okénko bílého cylindru je 35×35 a 30×30 v detekci myotube a detekci center myotube.

Krok II: Metoda segmentace myotub

V kroku II jsme detekovali myotuby a centra myotube pomocí prahových metod včetně trojúhelníkové metody a Otsuovy metody (Otsu, 1979 Zack a kol., 1977) (obr. 3, obr. 4) a jednotlivé myotuby byly segmentovány segmentací povodí pomocí detekovaných myotube a center myotube (Bajcsy a kol., 2015) (obr. 5). Krok II se skládal ze tří skupin, které obsahovaly celkem 11 dílčích kroků Krok II-i až II-iii, detekce myotube Krok II-iv až II-x, detekce center myotube Krok II-xi, segmentace povodí.

Detekce myotubes. (A) Detekce myotub se skládala ze tří dílčích kroků Krok II-i, první binarizace Krok II-ii, Sumační krok II-iii, druhá binarizace. V kroku II-ii se intenzita zvýší z modré na červenou. (B) Histogram intenzity FRET-YFP na snímku 0. Červená čára označuje prahovou hodnotu, která byla stanovena metodou trojúhelníku. (C) Histogram intenzity sečteného binárního obrazu. Červená čára označuje prahovou hodnotu stanovenou Otsuovou metodou. (D) Označené obrazy detekovaných myotubiček. Jedna barva odpovídá jedné souvislé oblasti myotube. Černá označuje oblast buď rezervních buněk nebo pozadí.

Detekce center myotube. (A) Detekce center myotube se skládá ze sedmi dílčích kroků Krok II-iv, první binarizace fluorescenčních časosběrných snímků Krok II-v, vzdálenostní transformace prvních binarizovaných snímků Krok II-vi, druhá binarizace snímků vzdálenostní mapy Krok II -vii, Sčítání druhých binárních obrazů Krok II-viii, třetí binarizace sečtených obrazů Krok II-ix, označení třetího binárního obrazu Krok II-x, odšumování označeného obrazu. Všimněte si, že v kroku II-v a II-vii barvy označují intenzitu v pixelu, zatímco v kroku II-ix a II-x odpovídá jedna barva jedné souvislé oblasti. Černá označuje buď rezervní buňky, nebo oblasti pozadí. (B) Skeletonizovaný obraz označeného obrazu. Červená šipka označuje úlomky krátké délky. (C) Histogram délky skeletonizovaného obrazu. Předpokládali jsme, že délka je počet pixelů v souvislé oblasti skeletonizovaného obrazu. Červená čára označuje prahovou délku určenou metodou trojúhelníku.

Segmentace povodí. (A) Myotuby a centra myotube byly detekovány z časosběrných snímků FRET-YFP. Detekovaná myotube byla použita jako hranice pro segmentaci povodí. Detekované centrum myotube bylo použito jako marker pro segmentaci povodí. Segmentace povodí byla provedena pomocí detekovaných myotube a center myotube, oblasti, které byly menší než 10 000, byly odstraněny. (B) Překryvy surového časosběrného obrazu FRET-YFP ve snímku 0 a výsledek segmentace povodí. Žluté čáry označují obrysy segmentovaných oblastí myotube.

Krok II-i až II-iii: Detekce myotub. Detekce myotub se skládá ze tří dílčích kroků, Krok II-i až II-iii (obr. 3A) Krok II-i, první binarizace časosběrných snímků FRET-YFP Krok II-ii, sumarizace prvních binarizovaných snímků Krok II- iii, druhá binarizace součtu obrazu.

V kroku II-i jsme detekovali kandidátské oblasti myotubes v každém obrazu tím, že jsme je binární (první binarizace kroku II-i na obr. 3A). Protože histogram intenzity fluorescence FRET-YFP byl zkosený doleva, byla k určení prahu pro první binarizaci použita metoda trojúhelníku (obr. 3B) (Zack a kol., 1977). Navíc, abychom zabránili kolísání prahové hodnoty v důsledku počtu pixelů, standardizovali jsme celkovou plochu histogramu intenzity na jednu před použitím trojúhelníkové metody. Binární snímky však zahrnovaly myotuby a fragmentované oblasti rezervních buněk. Abychom to omezili pouze na myotubes, bude zapotřebí vylepšený kontrast mezi myotubes a rezervními buňkami.

V kroku II-ii jsme sečetli binární obrazy (Krok II-ii Sumace na obr. 3A). Protože myotuby byly tlustší a jasnější než rezervní buňky, sumace binárních obrazů umožnila zvýšit kontrast mezi myotuby a rezervními buňkami.

V kroku II-iii jsme provedli sečtený binární obraz pro detekci myotubulů (krok II-iii Druhá binarizace na obr. 3A). Protože histogram intenzity sečteného obrázku byl bimodální, byla k určení prahu pro druhou binarizaci použita Otsuova metoda (obr. 3C). Otsuova metoda je metoda statistického prahování pro nalezení prahu, který minimalizuje rozptyl v rámci třídy (Otsu, 1979).

Myotubes jsme tedy detekovali postupnými metodami prahování, včetně metody trojúhelníku a Otsuovy metody, pomocí součtového binárního obrazu časosběrných snímků FRET-YFP (obr. 3D). Stále jsme však detekovali některé myotuby spíše jako jednu souvislou oblast než jako jednotlivé myotuby. K detekci jednotlivých myotubulů bude potřeba další segmentace.

Krok II-iv až II-x: Detekce center myotube. Pro segmentaci jednotlivých buněk se ve fluorescenčním zobrazování nejčastěji používala segmentace povodí (Bajcsy a kol., 2015). Při segmentaci povodí se obarvené buněčné jádro často používá jako marker buňky, protože většina buněčného typu je mononukleární a kulatá. Konvenční metody segmentace povodí využívající jádro jako marker jednotlivé buňky však nejsou navrženy k identifikaci buněk polynukleárního a protáhlého tvaru, jako jsou myotuby. Proto jsme místo jádra jako marker myotuby pro segmentaci povodí použili centrum myotube.

Detekce center myotube se skládá ze sedmi dílčích kroků, Krok II-iv až II-x (obr. 4A) Krok II-iv, první binarizace časosběrných snímků FRET-YFP Krok II-v, transformace vzdálenosti prvních binárních snímků Krok II-vi, druhá binarizace snímků vzdálenostní mapy Krok II-vii, sumace druhých binárních snímků Krok II-viii, třetí binarizace sečtených snímků Krok II-ix, označení třetího binárního snímku Krok II-x, odšumování označeného obrázku.

V kroku II-iv jsme vytvořili binární obrazy pomocí trojúhelníkové metody pro detekci kandidátních oblastí myotubulů.

V kroku II-v jsme transformovali binární obrazy na obrazy distanční mapy, které zdůrazňovaly centra myotube (Krok II-v Distance transformation na obr. 4A). Některé oblasti center myotube se však nepodařilo zvýraznit kvůli přítomnosti jader, a proto byly nadměrně segmentovány.

V kroku II-vi byly snímky mapy vzdáleností vytvořeny binárně pomocí metody trojúhelníku (krok II-vi Druhá binarizace na obr. 4A) a poté sečteny pro zdůraznění center myotube (souhrn kroku II-vii na obr. 4A). Vzhledem k tomu, že jaderné pozice v myotube byly často měněny, souhrnný obraz zmírnil vliv jaderné existence.

V kroku II-viii byl sečtený obraz binární pomocí Otsuovy metody pro detekci center myotube (Krok II-viii Třetí binarizace na obr. 4A).

V kroku II-ix jsme binární obraz označili jednou souvislou oblastí jako jedním středem myotube (Krok II-ix Označení na obr. 4A). Ačkoli se zdálo, že označený snímek ukazuje úspěšnou detekci center myotube, obsahoval spoustu malých úlomků v délce od jednoho do desítek pixelů (obr. 4B a C). Proto jsme odstranili trosky krátkou délkou, kde délka byla definována jako počet pixelů skeletonizované oblasti. Skeletonizace je ztenčovací algoritmus, který odstraňuje vnější pixely oblasti, aby našel její mediální osu. Pro přesnou segmentaci myotube je třeba tyto úlomky řádně odstranit.

Vzhledem k tomu, že délkový histogram středů myotube byl zkosený doleva, krok II-x použil k určení prahu trojúhelníkovou metodu (obr. 4C). Detekovali jsme jednotlivá centra myotube odstraněním oblastí menších než prahová hodnota (krok II-x odstranění šumu na obr. 4A, tabulka I).

Během prvních deseti dílčích kroků (krok II-i až II-x) jsme získali jednotlivou oblast myotube jako hranici pro segmentaci povodí a individuální centrum myotube jako marker pro segmentaci povodí. Metoda využívající centrum myotube místo jádra nám tedy umožnila segmentovat jednotlivé myotuby segmentací povodí.

Krok II-xi: Segmentace povodí. V kroku II-xi jsme aplikovali segmentaci povodí na myotuby detekované v kroku II-iii s použitím detekovaného centra myotube v kroku II-x jako markeru. Jednotlivé myotuby byly segmentovány odstraněním oblastí menších než práh (obr. 5).

Hodnocení segmentace

V této studii implementace trojúhelníkové metody a Otsuovy metody umožnila automatickou segmentaci myotubes. Protože však jak metoda trojúhelníku, tak Otsuova metoda jsou založeny na histogramu intenzity obrazu, výsledky segmentace mohou být ovlivněny intenzitou excitace a počtem časosběrných snímků. Proto jsme porovnali segmentační výkon naší metody s jinými tradičními segmentačními metodami (Otsuova metoda a trojúhelníková metoda) s různou propustností excitačního světla a různým počtem časosběrných snímků (obr. 6). Pozemní pravda myotubes byla generována z obrazu MIP ruční segmentací (obr. S1) a Jaccardův index (Levandowsky a Winter, 1971) byl vypočítán mezi základní pravdou a každou metodou. Jaccard index je indikátorem podobnosti mezi dvěma regiony (Bajcsy a kol., 2015). Čím vyšší hodnota indexu, tím větší podobnost. Všimněte si, že stejně jako základní pravda, metoda Otsu a metoda trojúhelníku prováděly segmentaci pomocí obrázků MIP. Bylo to výhodné srovnání výkonu s metodou Otsu a metodou trojúhelníků. Všimněte si také, že je těžké připravit perfektní základní pravdu pro buňky s nejednoznačnými hranicemi mezi buňkami.

Přesnost segmentace. (A) Levý panel: Reprezentativní výsledky segmentace s indikovanou propustností excitačního světla (25 %, 12 %, 6 % a 3 %). Žluté čáry jsou obrysy jednotlivých myotub. Pravý panel: Reprezentativní výsledky segmentace při změně počtu časosběrných snímků převzorkováním každých dvou až deseti snímků. Full zobrazuje výsledky segmentace pomocí celé sady obrázků. Každé 2, Každých 5 a Každých 10 označují výsledky segmentace získané převzorkováním snímků v každých dvou, pěti a deseti časových bodech. Propustnost byla nastavena na 25 %. (B) Jaccard indexy v každém stavu v (A) (medián ± iqr, n = 8 fázových pozic). Výsledek segmentace pozemské pravdy byl použit jako reference pro výpočet Jaccardova indexu. N. S. (nevýznamné), p>gt0,05 (Welchův t-test). p hodnoty byly korigovány Bonferroniho korekcí.

Naše metoda vykazovala významně vyšší Jaccardův index než tradiční segmentační metody s 12 % nebo menší propustností excitačního světla (obr. 6A levý panel, 6B levý panel). Tento výsledek ukazuje, že naše metoda je odolnější vůči změně intenzity excitace než tradiční metody segmentace. Pro snížení počtu snímků není za všech podmínek žádný významný rozdíl. (Obr. 6A pravý panel, 6B pravý panel). Tyto výsledky naznačují, že výkon segmentace naší metody je srovnatelný s tradiční metodou segmentace podle počtu použitých obrázků.Kromě toho má naše metoda výhodu v tom, že sousední myotuby lze oddělit implementací detekce středu myotube jako markeru pro segmentaci povodí.

Krok III: Metoda korekce pozadí

V důsledku různých faktorů, včetně nastavení optického systému, vlastností detektoru a fluorescenční sondy, fluorescenční obraz často obsahuje změny intenzity pozadí ve stejném poli. Kromě toho se fluorescenční zobrazování živých buněk často provádí se slabým excitačním světlem, aby se zabránilo foto-bělení a fototoxicitě, což vytváří obraz s nízkým poměrem signálu k šumu. V poměrových datech, jako je poměr FRET, vede selhání identifikace oblastí pozadí k významným artefaktům při kvantifikaci intenzity signálu. Proto je pro kvantitativní získávání signálu nutná správná korekce pozadí (Zimmermann a kol., 2003).

Ruční výběr oblastí pozadí v blízkosti oblastí zájmu (ROI) se široce používá pro korekci pozadí (Ceelen a kol., 2007 Horie a kol., 2015 Rahar a kol., 2018). V případě diferencovaných buněk C2C12 je však obtížné ručně identifikovat oblasti pozadí, protože rezervní buňky zabírají prostory mezi myotubi (obr. 1). Zde jsme použili dvoukomponentní Gaussův směsový model (GMM) k odhadu oblastí pozadí.

Korekce pozadí sestávala z pěti dílčích kroků (obr. 7) Krok III-i, projekce maximální intenzity (MIP) časosběrných snímků FRET-YFP, Krok III-ii, binarizace snímku MIP Krok III-iii, NOT AND (NAND ) operace na nezpracovaných časosběrných fluorescenčních snímcích a binárním MIP snímku Krok III-iv, odhad intenzity pozadí pomocí dvousložkového modelu Gaussovy směsi (GMM). Krok III-v, kvantifikace intenzity signálu jednotlivých myotub.

Korekce pozadí. Korekce pozadí se skládá z pěti dílčích kroků Krok III-i, projekce maximální intenzity (MIP) Krok III-iii, operace NOT AND (NAND) Krok III-iv, dvousložkový model Gaussovy směsi (GMM). Krok III-v, kvantifikace intenzity signálu. V kroku III-iii se intenzita zvýší z modré na červenou. V kroku III-iv červená čára označuje odhadovanou distribuci intenzity pozadí a červená přerušovaná čára označuje průměr distribuce jako odhadovanou intenzitu pozadí. Žlutá čára označuje odhadovanou distribuci intenzity v oblasti, která zahrnovala rezervní buňky a mrtvé buňky. V kroku III-v odpovídá každá modrá čára časovým řadám každé jednotlivé myotube. Červená čára označuje střední časovou řadu FRET poměru myotubulů v každé korekci pozadí.

MIP v kroku III-i je procesní technika, která udržuje pouze pixely maximální intenzity podél osy z obrazů zásobníku.

V kroku III-ii umožnila binarizace MIP snímků odvozených z FRET-YFP časosběrných snímků spolehlivou separaci myotubulů od jiných oblastí složených z rezervních buněk a oblastí pozadí (krok III-ii na obr. 7).

V kroku III-iii jsme provedením operace NAND na nezpracovaných časosběrných fluorescenčních snímcích a binárním MIP snímku extrahovali oblast složenou z rezervních buněk a oblastí pozadí z každého časosběrného snímku (krok III-iii na obr. 7 ).

V kroku III-iv jsme odhadli intenzitu pozadí časosběrných snímků CFP i FRET-YFP pomocí dvousložkového GMM (krok III-iv na obr. 7). Ve dvousložkovém GMM byl histogram rozdělen na dvě složky rozložení Gaussových směsí, které odpovídaly rozložení signálu v oblasti, která zahrnovala rezervní buňky a oblasti pozadí, a intenzita pozadí byla odhadnuta jako průměr nižší složky.

V kroku III‑v jsme odečetli odhadovanou intenzitu pozadí od každého časového bodu časosběrných snímků CFP a FRET-YFP, kvantifikované intenzity signálu CFP a FRET-YFP v jednotlivých myotubech (obr. S2, pravý panel) a získali časovou řadu poměru FRET (FRET-YFP/CFP) (krok III-v na obr. 7).

Vyhodnocení korekce pozadí

Pro vyhodnocení přesnosti korekce pozadí pomocí dvousložkového GMM jsme porovnali přesnost korekce pozadí pomocí dvousložkového GMM s jinými metodami automatické korekce pozadí pomocí hrubého histogramu (RAW) a odhadu hustoty jádra (KDE) (obr. 8). Při korekci pozadí pomocí RAW byla intenzita pozadí odhadnuta jako intenzita režimu histogramu. Při korekci pozadí pomocí KDE byla intenzita pozadí odhadnuta jako intenzita módu histogramu aproximovaná odhadem hustoty jádra.

Porovnání přesnosti korekcí pozadí pomocí RAW, KDE a dvousložkového GMM. (A) Horní panely: časové řady FRET-poměru (FRET-YFP/CFP) jednotlivých myotrubic v RAW, KDE, respektive GMM (n=96, osm fázových pozic). Zde jsme použili stejné fluorescenční snímky s časovým odstupem pro všechny korekce pozadí pomocí RAW, KDE a dvousložkového GMM. Jedna modrá čára odpovídá časové řadě jedné myotube. Červená čára označuje průměrnou časovou řadu FRET poměru myotube v každé korekci pozadí. Dolní panely: absolutní diferenciální časové řady prvního řádu poměru FRET jednotlivých myotub v každé korekci pozadí. Červená čára označuje průměrné časové řady diferenciálních časových řad absolutního prvního řádu. (B) AUC distribuce absolutních diferenciálních časových řad prvního řádu myotube v každé korekci pozadí. *, p< 0,05 (Steel-Dwassův test). V každém houslovém grafu jsou ve vložce zobrazeny krabicové grafy a bílá tečka označuje medián.

Kroky III-i až III-iii jsou běžnými kroky pro všechny opravy pozadí pomocí RAW, KDE a dvoukomponentního GMM. V kroku III-iv byla intenzita pozadí odhadnuta pomocí RAW, KDE a dvousložkového GMM. V kroku III-v byly získány časové řady poměru FRET (FRET-YFP/CFP) pomocí každé metody korekce pozadí (obr. 8A).

Pro vyhodnocení přesnosti korekcí pozadí pomocí RAW, KDE a dvousložkového GMM jsme vypočítali kvantifikační šum časové řady poměru FRET v myotube při indexu snímku i tak jako di a celkový kvantifikační šum myotube as AUC, popsal

kde < y i >i = 1 N je časová řada FRET poměru na indexu rámce i, N je celkový počet snímků Δt je časový interval mezi snímky, < d i >i = 1 N - 1 je absolutní rozdílová časová řada prvního řádu mezi yi a yi–1 (obr. 8A, spodní panel), a AUC je oblast pod křivkou di v Eq (1).

Medián AUC korekce pozadí s použitím dvousložkového GMM byla významně menší než u korekcí používajících RAW nebo KDE (obr. 8B), což naznačuje, že dvousložkový GMM poskytuje nejnižší kvantifikační šum ze tří metod. Kromě toho má GMM výhody v tom, že odhadované rozdělení bylo spojité a parametry včetně průměru a rozptylu v Gaussově složce byly určeny automaticky.

Porovnali jsme přesnost korekcí pozadí pro ruční odhad a dvousložkový GMM (obr. S1 a obr. 9). V manuálním odhadu jsme vygenerovali MIP obraz z časosběrných snímků FRET-YFP a vizuálně jsme vybrali oblasti myotubes a pozadí (obr. S1). Pro každou vybranou oblast jsme kvantifikovali intenzity signálu CFP a FRET-YFP a vypočítali časovou řadu poměru FRET (Manuál na obr. 9A). U dvousložkového GMM byl poměr FRET vypočítán z intenzit CFP a FRET-YFP v ručně vybraných oblastech (Manuální+dvousložkový GMM na obr. 9A). Nebyl žádný významný rozdíl v distribucích AUCje mezi třemi metodami korekce pozadí, což naznačuje, že námi navrhovaná metoda využívající dvousložkový GMM umožnila objektivní a přiměřenou kvantifikaci ve srovnání s manuálním odhadem (obr. 9B).

Porovnání přesnosti korekce pozadí pomocí Manual a Manual+dvoukomponentní GMM. (A) Horní panely: časové řady poměru FRET (FRET-YFP/CFP) jednotlivých myotubulů v manuálním a manuálním+dvousložkovém GMM (n=80, osm stupňů poloh). Byl ukázán výsledek korekce pozadí pomocí automatické segmentace myotube a dvousložkového GMM na obr. 6 (dvousložkový GMM). Jedna modrá čára odpovídá časové řadě jedné myotube. Červená čára označuje střední časovou řadu FRET poměru myotubulů v každé korekci pozadí. Dolní panely: absolutní diferenciální časová řada prvního řádu FRET poměru jednotlivých myotrubic v každé korekci pozadí. Červená čára označuje střední časovou řadu absolutní diferenciální časové řady 1. řádu. (B) AUC distribuce absolutních diferenciálních časových řad prvního řádu myotube v každé korekci pozadí. N. S. (nevýznamné), p>0,05 (Steel-Dwassův test). V každém houslovém grafu jsou ve vložce zobrazeny krabicové grafy a bílá tečka označuje medián.

V intramolekulárním biosenzoru FRET, jako je Eevee-S6K, jsou CFP a YFP propojeny doménou linkeru a celkové šumy časových řad CFP a FRET-YFP by měly vykazovat vysokou korelaci v ustáleném stavu. Proto jsme zkoumali koeficient determinace AUCs mezi CFP a FRET-YFP (obr. 10). Koeficienty determinace AUCs v korekci pozadí pomocí RAW, KDE a dvousložkového GMM byly 0,822, 0,854 a 0,924 (obr. 10, horní panely). Podobně koeficienty determinace AUCs v ručním a ručním + dvousložkovém GMM byly 0,899, respektive 0,892 (obr. 10, spodní panely). Korekce pozadí pomocí dvoukomponentního GMM tedy ukazuje nejvyšší koeficient determinace AUCs diferenciální časové řady absolutního prvního řádu mezi CFP a FRET-YFP, což naznačuje, že dvoukomponentní GMM je nejrozumnější metodou pro korekci pozadí.

Koeficienty stanovení mezi časosběrnými snímky CFP a FRET-YFP v každé kvantifikační metodě. Jedna tečka odpovídá jedné myotube. Černá čára je regresí AUCs CFP a FRET-YFP.

Dále jsme zkoumali, zda námi navrhovanou metodu využívající dvousložkovou GMM lze použít pro myotubes za jiných podmínek, jako jsou myotubes stimulované inzulínem nebo myotubes exprimující sondu ATP stimulovanou elektrickou pulzní stimulací (EPS) (obr. 11). Nejprve jsme použili inzulínem stimulované diferencované buňky C2C12 stabilně exprimované Eevee-S6K (obr. 11A, horní panely). Jednotlivé myotuby byly identifikovány a kvantifikovány manuálním odhadem nebo námi navrženou metodou s použitím GMM (obr. 11B, horní panely). Vypočítali jsme korelační koeficient mezi časovou řadou FRET poměru kvantifikovaného manuálním odhadem a dvousložkovým GMM v každé oblasti, kde byl Jaccardův index větší než 0,5 (obr. 11C, horní panel). Většina korelačních koeficientů byla větší než 0,98, což naznačuje, že námi navrhovaná metoda využívající dvousložkový GMM je srovnatelná s manuálním odhadem. Kromě toho jsme použili EPS-stimulované diferencované C2C12 buňky stabilně exprimované mitAT1.03, což je FRET biosenzor pro monitorování koncentrace ATP v mitochondriích (Imamura a kol., 2009) (obr. 11A, spodní panel) a byly kvantifikovány jednotlivé myotuby (obr. 11B, spodní panely). Podobně jako u Eevee-S6K byly všechny korelační koeficienty větší než 0,98 (obr. 11C, spodní panel), což naznačuje, že námi navrhovaná metoda využívající dvousložkový GMM je srovnatelná s manuálním odhadem.

Kvantifikace signální aktivity koncentrace S6K a ATP aplikací námi navržené metody. (A) Časová prodleva snímku s poměrem FRET. Diferencované buňky C2C12 stabilně exprimující Eevee-S6K byly stimulovány 100 nM inzulínu po 50 minutách. Diferencované buňky C2C12 stabilně exprimující mitAT1.03 byly stimulovány EPS (10 ms s 50 V, 1Hz intervalem) v 10 min a pokračovalo se po dobu 15 min. (B) Časová řada poměru FRET (FRET-YFP/CFP) v reakci na inzulín (n=90, osm pozic ve fázi) a EPS (n=10, pozice v jedné fázi) kvantifikované dvousložkovým GMM a kvantifikované manuálně (n=80, osm pozic ve fázi, inzulín a n=10, pozice v jedné fázi, EPS). Jedna modrá čára odpovídá jedné myotube. Červená přerušovaná čára označuje časové body inzulinové stimulace. Červená vyplněná oblast označuje období EPS. (C) Histogramy Pearsonových korelačních koeficientů časové řady poměru FRET mezi dvousložkovým GMM a Manual v reakci na inzulín (horní panely) a EPS (dolní panely).

Rozdíly mezi populací a jednotlivými myotubami

Náš navrhovaný rámec si klade za cíl objektivně kvantifikovat časové řady fluorescenčních časosběrných snímků v živých individuálních myotubech. Pomocí rámce jsme se pokusili kvantifikovat aktivaci S6K závislou na inzulínu a hledali jsme různé vlastnosti mezi buněčnou populací a individuální myotube.

Myotuby byly stimulovány různými dávkami inzulínu (0 nM až 100 nM) a ze získaných fluorescenčních časosběrných snímků byly kvantifikovány časové řady aktivity S6K v jednotlivých myotubách (obr. 12A). Z časové řady jsme definovali vlastnosti časových řad, jako je Peak, Peak time, AUC atd. (obr. 12A pravý dolní panel, B). Pro buněčnou populaci se vrchol, AUC, poločas adaptace a intenzita v poločase adaptace zvýšily v závislosti na dávce inzulínu. Rozptyl v době vrcholu se snížil a přesnost adaptace se mírně snížila v závislosti na dávce inzulínu.

Aktivace S6K závislá na inzulínu v jedné myotube a buněčné populaci. (A) Časová řada FRET-poměru (FRET-YFP/CFP) v reakci na různé dávky inzulínu v jednotlivých jednotlivých myotubech. Od kontroly do 100 nM byl počet myotubu n=98, 102, 100, 97, 86, 103 a 98, v daném pořadí. Jedna modrá čára odpovídá časové řadě jedné myotube. Červená čára označuje střední řadu každé časové řady. Pravý dolní panel je definice vlastností časové řady. (B) Odezva buněčné populace časové řady v (A). Na každém houslovém grafu jsou ve vložce zobrazeny krabicové grafy a bílá tečka označuje medián. Červená čára označuje střední řadu jednotlivých vlastností.

Abychom prozkoumali rozdíl ve vlastnostech mezi buněčnou populací a jednotlivci, provedli jsme korelační analýzu s podmnožinou bootstrap (Bootstrap) jako buněčnou populací a všemi daty (All) jako jednotlivci (obr. 13). Korelace doby vrcholu se všemi ostatními vlastnostmi se významně lišila mezi buněčnou populací a jednotlivci. Také korelace poločasu adaptace se všemi ostatními vlastnostmi se významně lišila mezi buněčnou populací a jednotlivci. Tyto výsledky naznačují, že doba vrcholu a poločas adaptace vykazují různé reakce mezi buněčnou populací a jednotlivci. Důvodem, proč byl čas vrcholu významně odlišný v kombinacích se všemi vlastnostmi, může být to, že rozptyl času vrcholu se snižoval v závislosti na dávce inzulínu (obr. 12B). V souladu s tím byly korelace mezi dobou vrcholu se všemi ostatními vlastnostmi sníženy v závislosti na dávce inzulínu (obr. S3).

Korelace mezi vlastnostmi v jednotlivých myotubech a populaci. (A) Spearmanovy korelační koeficienty mezi vlastnostmi. Všechny (n = 684) a Bootstrap (n = 700) indikují korelace u všech jednotlivců a podmnožin populace bootstrap populace myotubes. Podmnožiny bootstrapu v každé dávce byly generovány 100krát opakováním, aby se náhodně odebralo 10 bodů a vypočítal se medián. Azurové obdélníky korelace vyšší v buněčné populaci než u jedinců, purpurové obdélníky korelaci vyšší u jedinců než v buněčné populaci, žluté obdélníky obrácenou korelaci mezi buněčnou populací a jednotlivci. (B) Rozdíl v korelačních koeficientech mezi All a Bootstrap. N. S. (nevýznamné), *p<10–3 , **p& lt10 –5, ***p<10–7 . z skóre je testová statika rozdílu mezi dvěma korelačními koeficienty (viz Materiály a metody).

Dále jsme analyzovali poločas adaptace, který vykazuje významné rozdíly od všech ostatních vlastností kromě doby špičky. Rozdíly ve vlastnostech mezi buněčnou populací a jedinci lze klasifikovat do tří skupin, které vykazují vyšší korelaci v buněčné populaci než jednotlivci, vyšší korelaci u jednotlivců než buněčná populace a obrácený vztah mezi buněčnou populací a jednotlivci (obr. 13 ). V kombinaci poločasu adaptace vykazovaly vrchol a AUC silnější korelaci s poločasem adaptace v buněčné populaci než u jedinců (obr. 13A, B). V souladu s tím byly distribuce vrcholu a AUC v buněčné populaci více odděleny než jednotlivci (obr. S4A). Přesnost adaptace ukázala vyšší korelaci s poločasem adaptace u jedinců než v buněčné populaci (obr. 13A, B). Kromě toho se korelace poločasu adaptace s přesností adaptace v každé dávce snížila v závislosti na dávce inzulínu (obr. S3 dole uprostřed). To naznačuje, že poločas adaptace a přesnost adaptace u jedinců různě reagovaly v závislosti na dávce inzulínu. Korelace mezi intenzitou poločasu adaptace a poločasem adaptace v buněčné populaci byla pozitivní, zatímco u jedinců byla negativní (obr. 13A, B). Distribuce Half-life adaptace a intenzity na Half-life adaptace pro každou dávku se měnila v negativní korelaci směru u jednotlivců, ale ne v buněčné populaci (obr. S4C). Kromě toho korelace poločasu adaptace s intenzitou při poločasu adaptace v každé dávce inzulínu byly u jednotlivců negativní (obr. S4 vpravo dole). Tyto výsledky naznačují, že jednotlivci mají skryté vlastnosti, které nelze v buněčné populaci vidět. Některé vlastnosti aktivace S6K závislé na dávce inzulínu se tedy liší mezi buněčnou populací a jednotlivci.

Výhody automatické segmentace myotube

Automatická segmentace buněk ve fluorescenčních snímcích byla vyvinuta pro mononukleární buňky a buňky kulatého tvaru (Bajcsy a kol., 2015 Kodiha a kol.(2011). Nicméně metoda automatické segmentace pro prodloužené polynukleární buňky, jako jsou diferencované myotuby C2C12, musí být ještě vyvinuta. Skutečně byla měřena intracelulární signální aktivita a reaktivní formy kyslíku v myotubách in vitro pouze ručním výběrem ROI myotubes (Ceelen a kol., 2007 Horie a kol., 2015 Rahar a kol., 2018). Protože naše metoda nepředpokládá počet jader a tvar buněk, lze naši metodu použít pro jakýkoli typ polynukleárních a deformovaných buněk. Protože však naše metoda neimplementuje sledování buněk, je obtížné ji aplikovat na pohyblivé buňky. Použitím naší metody pro snímky v každém pevném období a implementací sledování buněk existuje možnost, že naši metodu lze aplikovat na pohybující se buňky.

Některé nedávné studie využívající hluboké učení ukázaly zlepšení přesnosti a propustnosti segmentace buněk (Van Valen a kol., 2016). Hluboké učení je účinný nástroj pro segmentaci buněk s vysokou přesností a vysokou propustností a lze jej efektivně použít pro prodloužené polynulcearní buňky, jako jsou myotubes C2C12. Navzdory všestrannosti hlubokého učení pro jakýkoli typ buněk vyžaduje hluboké učení obrovský tréninkový soubor dat a výpočetní zdroje obecně. Zejména v buňkách s nejednoznačnou buněčnou hranicí, jako je myotube, se hluboké učení může naučit zkreslení manuální segmentace. Naproti tomu námi navrhovaná metoda nevyžaduje žádné školení a málo výpočetních zdrojů.

Doba výpočtu naší metody byla méně než 15 minut i při zpracování 131 snímků včetně segmentace po kvantifikaci pomocí AMD Ryzen 7 1800X (tabulka II). Když byla provedena pouze segmentace, naše metoda trvala asi 30 sekund pro jednu datovou sadu (131 snímků). To je dostatečně rychlé ve srovnání s manuální segmentací, která pomocí nástroje Roi na Fidži zabrala asi 15–20 minut. Při korekci pozadí trval dvousložkový GMM asi 3 sekundy na snímek. Toto je praktická doba, protože naše metoda byla po nastavení parametrů segmentace plně automatizována.

Krok Průměr ± S.D.
(s)
Max
(s)
Detekce myotubulů (krok II-i až II-iii) a 6.13±0.52 6.82
Detekce center myotube (krok II-iv až II-x) b 24.97±3.72 32.33
Povodí (krok II-xi) c
d. Korekce pozadí (krok III). 2.94±0.84 4.73

Protože (a), (b) a (c) jsou dávkové procesy, byly časy výpočtu měřeny pro každou datovou sadu (1344 × 1024 pixelů, 131 snímků) s osmi pozicemi stupňů (n = 8). (c) byl příliš rychlý na měření doby výpočtu. Vzhledem k tomu, že (d) je sekvenční proces pro každý snímek, byla doba výpočtu měřena u každého snímku (131 snímků, osm poloh jeviště, n=1048).

Heterogenita buněčné odpovědi

Kvantifikovali jsme aktivitu S6K v jednotlivých myotubech a ukázali jsme, že některé vlastnosti aktivity S6K v inzulínově závislém způsobu inzulínu se liší mezi buněčnou populací a jednotlivci. To zvyšuje možnost, že některé vlastnosti mohou být podceněny nebo nesprávně odhadnuty analýzou buněčné populace. Kromě toho bude analýza jednotlivých buněk řešit, zda je variace buněčné populace odvozena z intracelulární variace nebo mezibuněčné variace.

Je také známo, že aktivita jiných signálních molekul se mezi jednotlivými buňkami liší. Například u mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK) byla asynchronní oscilace odpovědi p38 MAPK na vnější stimulaci odhalena analýzou jedné buňky (Tomida a kol., 2015). V případě kalciové odpovědi na stimulaci ATP byl odhalen rozptyl kalciové odpovědi, který je způsoben vnitřním stavem buněk (Yao a kol., 2016).

Celkově vzato, jednobuněčná analýza je důležitá pro odhalení skrytých vlastností buněčného systému, které nelze v buněčné populaci pozorovat. Přenos signálu v kosterním svalu byl dosud studován konvenčními biochemickými a molekulárně biologickými metodami, jako je western blot, které odrážejí aktivitu na úrovni buněčné populace (Areta a kol., 2014 Baar a Esser, 1999 Dalle Pezze a kol., 2016 Deldicque a kol., 2008 Západ a kol., 2016). Na rozdíl od toho naše navrhovaná metoda může automaticky detekovat a kvantifikovat signální aktivitu jedné myotube a otevře dveře k jednobuněčné analýze v signální transdukci kosterního svalu.

Konstrukce C2C12 buněčné linie stabilně exprimující fluorescenční biosenzory

Buňky C2C12 (laskavě poskytnuté společností Takeaki Ozawa, University of Tokyo, Tokio, Japonsko) byly kultivovány při 37 °C pod 5 % CO2 v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM), (High Glucose) s L-glutaminem a fenolovou červení (Wako Pure Chemical Industries Limited, Osaka, Japonsko) doplněném 10% fetálním bovinním sérem (Nichirei Bioscience Incorporated, Japonsko). Buňky C2C12 stabilně exprimující biosenzory FRET, Eevee-S6K (plazmid laskavě poskytl Kazuhiro Aoki, Národní institut pro základní biologii, Aichi, Japonsko) (Aoki a Matsuda, 2009 Komatsu a kol., 2011) a mitAT1.03 (plazmid laskavě poskytl Hiromi Imamura, Kyoto University, Kyoto, Japonsko) (Imamura a kol., 2009), byly zkonstruovány pomocí systému PiggyBac Transposase System (System Biosciences, U.S.A.). Tři sta μl Opti-MEM (Life technologies, USA), 4 μL Lipofectaminu 2000 (Invitrogen, USA), 1,0 μg klonu transposonu PiggyBac (laskavě poskytl Kazuhiro Aoki, National Institute for Basic Biology, Aichi, Japonsko) a 0,2 μg PiggyBac transposázového expresního vektoru (PB210PA-1, Funakoshi, Japonsko) bylo smícháno a ponecháno stát 5 min. Poté bylo 70% konfluentních buněk C2C12 umístěno na 35 mm misku a transfekováno směsí a inkubováno po dobu 6 hodin. Pro selekci infikovaných buněk byly buňky kultivovány s DMEM (vysoká hladina glukózy) s L-glutaminem a fenolovou červení obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra a 20 ug/ml blasticidinu S hydrochloridu (Wako, Japonsko). Vybrané buňky byly nasazeny na misku Cell Culture Dish 430167 (Corning Incorporated, U.S.A.) a kultivovány, dokud se nevytvořily kolonie. Kolonie byly odebrány a naočkovány na misku Cell Culture Dish 430167. Po naočkování a proliferaci byly buňky skladovány v koncentraci 1,0 x 105 buněk/ml pomocí Bambanker (NIPPON Genetics, Japonsko). Eevee-S6K je lokalizován v cytosolu a mitAT1.03 je lokalizován v mitochondriích.

Indukce diferenciace buněk C2C12

Pro indukci diferenciace byly buňky C2C12 naneseny na 35 mm/kolagenem potažený miskový kolagen typu I (IWAKI, Japonsko) v koncentraci 1,0 x 105 buněk/misku a kultivovány po dobu dvou dnů za výše popsaných podmínek, dokud nebyly konfluentní, a poté konfluentní buňky byly kultivovány v DMEM s L-glutaminem a fenolovou červení doplněné 2% koňským sérem (Nichirei Bioscience Incorporated) po dobu sedmi dnů (Odelberg a kol., 2000).

Fluorescenční časosběrné zobrazování

Myotubes C2C12 byly ponechány hladovět ve 2 ml média Medium199, Hanks’ Balanced Salts (Life technologies, U.S.A.) přes noc a poté byl minerální olej (Sigma Aldrich) stratifikován, aby se zabránilo odpařování média před fluorescenčním časosběrným zobrazováním. Fluorescenční časosběrné zobrazování bylo provedeno pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu IX 83 (Olympus, Tokio, Japonsko) vybaveného objektivem UPLSAPO10X2 (Olympus), CCD kamerou ORCA-R2 C10600-10B (Hamamatsu Photonics), U-HGLGPS rtuťová lampa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), emisní filtr XF3075 a XF3079 pro CFP a YFP (Omega Optical) a automaticky programovatelný XY stolek MD-XY30100T-META (Molecular Devices).

Všechny obrázky myotubes byly 1344 × 1024 pixelů a 0,645 μm/pixel. Časosběrné snímky myotrubic exprimujících Eevee-S6K byly pořizovány po dobu 650 minut každých 5 minut (celkem 131 snímků) s osmi polohami jevů. Časosběrné snímky myotrubic exprimujících mitAT1.03 byly pořizovány po dobu 45 minut každou 1 minutu (celkem 46 snímků) s jednou polohou ve fázi. Po odečtení pozadí byly snímky s poměrem FRET-YFP/CFP vytvořeny pomocí softwaru Meta-Morph (Universal Imaging, West Chester, PA).

Námi navrhovaná metoda byla vyvinuta pomocí modulů Python a Python, včetně Mahotas (Coelho, 2013), Scikit-image (van der Walt a kol.(2014) a Scikit-learn (Pedregosa a kol., 2011) pro automatickou kvantifikaci. Fidži (Schindelin a kol., 2012) byl použit pro manuální kvantifikaci intenzity fluorescence FRET-YFP a CFP. Intenzity FRET-YFP a CFP byly zprůměrovány na celou oblast myotube.

Význam rozdílu dvou korelačních koeficientů

Fisher's z-transformace korelačních koeficientů r je dána

kde i je index korelačního koeficientu. A z skóre rozdílu dvou korelačních koeficientů, popsaných

kde n1 a n2 jsou počty dat odpovídající r1 a r2. Jako z skóre sleduje normální rozdělení, test významnosti byl proveden s hladinou významnosti α=10 –3 , 10 –5 , 10 –7 .

Dostupnost dat a materiálů

Datové sady časosběrných snímků, výsledky segmentace a segmentační programy jsou k dispozici v naší databázi (http://kurodalab.org/info/Inoue).

Děkujeme Kazuhiro Aoki za laskavé poskytnutí biosenzoru FRET, Eevee-S6K.

Děkujeme Shinsuke Uda za užitečné diskuse a technické rady. Děkujeme našim členům laboratoře Masashi Fuji a Atsushi Hatano za jejich kritické čtení tohoto rukopisu, užitečné diskuse a technickou pomoc s experimenty.

Tato práce byla podpořena organizací Create of Fundamental Technologies for Understanding and Control of Biosystem Dynamics, CREST, Japonské vědecké a technologické agentury (JST) (#JPMJCR12W3) a Japonskou společností pro podporu vědy (JSPS) Číslo grantu KAKENHI (17H06300, 17H06299, 18H03979). K. Kunida získává finanční prostředky z grantu pro mladé vědce (B) (#16K19028).


Junior Academy of Science v Jižní Karolíně

Kachexie je syndrom ochabování svalů, který se vyskytuje u pacientů s pozdními stádii rakoviny. Vede k rychlé ztrátě tělesného tuku a tkáně kosterního svalstva a má významný dopad na úmrtnost pacientů. Kachexie je multifaktoriální, ale studie ukázaly, že vysoké hladiny zánětlivých cytokinů, jako je IL-6 a LIF, vyvolávají příznaky, které podporují toto ochabování svalů. Není však známo, zda je to způsobeno nadměrnou expresí syntézy proteinů nebo zvýšenou degradací proteinů. LIF je cytokin v rodině IL-6 a je třeba změřit jeho dopad na kachexii. Buňky C2C12 byly ošetřeny LIF po dobu 24 hodin před odběrem a byly měřeny rychlosti atrofie myotube a syntézy proteinů, aby se určila role LIF na kachexii. Myotuby byly vyfotografovány a byly vypočteny průměrné průměry skupin pěstovaných s LIF a bez LIF. Puromycin, který byl zaveden do buněčných kultur 30 minut před odběrem, a obsah p6070SK byl měřen pro kontrolní a experimentální skupinu pomocí western blotu. Buněčné skupiny, kterým byl zaveden LIF, měly menší průměr myotube a byly méně organizované než kontrolní skupina. Buněčné skupiny s LIF měly ve svých buňkách významně nižší množství puromycinu a p6070SK. Na základě těchto výsledků LIF vyvolává symptomy symptomy myotube atrofie, stejně jako rychlost syntézy proteinů. Je však zapotřebí dalšího výzkumu, abychom pochopili signální dráhy LIF a vliv ostatních cytokinů na kachexii.


Diferenciace lidské myotube in vitro v různých kultivačních podmínkách

Buňky lidského svalu odvozené ze satelitních buněk, udržované ve standardních podmínkách tkáňové kultury, se nerozlišují tak rychle nebo úplně jako myoblasty z jiných druhů (kuře, krysa, myš). Ve snaze zlepšit myogenezi jsme studovali účinky modifikace kultivačního média a společné kultivace svalu s nervovými buňkami, přičemž jako základ pro srovnání jsme použili myoblasty pěstované ve standardních kultivačních médiích. Myogeneze byla měřena pomocí fúzního indexu, aktivity kreatinkinázy (CK), aktivity acetylcholinesterázy (AChE) (celkové a molekulární formy) a počtu acetylcholinových receptorů (AChR). Modifikace kultivačního média urychlila fúzi myoblastů, ale hustota buněk se snížila a myotuby nebyly schopny přežít po dlouhou dobu. Naproti tomu společná kultivace svalu s nervovými buňkami zvýšila jak hustotu buněk, tak počet myotub. CK, AChE a AChR se zvýšily v přítomnosti definovaných médií. V kokulturách nervových svalů byl nárůst méně výrazný. Manipulace s kultivačními podmínkami modifikovala molekulární formy AChE. V kontrolních kulturách byl přítomen pouze pík (4 + 6,5) S, ale v definovaném médiu se objevil 10S pík. Forma 16S byla detekována pouze v kokulturách nervových svalů. Tato studie ukazuje, že fúzi lidských myoblastů a diferenciaci myotubulů v tkáňové kultuře lze urychlit odstraněním sérových makromolekul. Další diferenciace myotubií byla dosažena pouze v nervově-svalových kokulturách.


Podívejte se na video: Wie schaffst du es jeden Menschen zu analysieren mit Maxim Mankevich (Prosinec 2022).