Informace

9.6: Konjugace - Biologie

9.6: Konjugace - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Existují dva další procesy, které mohou vést k horizontálnímu přenosu genů v bakteriích: konjugace a transdukce. Na rozdíl od transformace tyto procesy „přinutí“ DNA do buňky, která může být váhavá. V procesu konjugace můžeme rozlišit dva typy bakteriálních buněk (stejného druhu). Jeden obsahuje plazmid známý jako plazmid pohlavního faktoru (F). Tyto jsou známé jako buňky Hfr (vysokofrekvenční rekombinace). Tento plazmid obsahuje geny potřebné k přenosu kopie jeho DNA do buňky, ve které chybí F-plazmid, takzvaná F-buňka. Občas se F-plazmid může integrovat (vložit) sám do chromozomu hostitelské buňky, a když k tomu dojde, systém zprostředkovaný F-plazmidem může přenášet geny hostitelské buňky (kromě plazmidových genů) do F-buňky. Abychom to trochu zjednodušili, budeme buňku Hfr označovat jako dárce DNA a F -buňky jako příjemce DNA.

K zahájení konjugace vytvoří Hfr buňka fyzický most k F-buňce. Přerušení DNA dárce zahájí proces, při kterém se syntetizuje jednovláknová DNA a přesune se do buňky příjemce (F–). Množství transportované DNA je do značné míry určeno tím, jak dlouho zůstane transportní můstek neporušený. Přenos celého dárcovského chromozomu z Hfr do F -buňky trvá přibližně 100 minut. Jakmile je DNA uvnitř F -buňky, je integrována do chromozomu příjemce a nahrazuje jeho verze přenesených genů (procesem známým jako homologní rekombinace). Pomocí kmenů Hfr s integrovanými F -plazmidy nesoucími různé alely různých genů a kontrolou doby konjugace (oddělení buněk umístěním do kuchyňského mixéru) byli experimentátoři schopni určit pořadí genů podél chromozomu. Výsledkem bylo zjištění, že příbuzné organismy mají stejné geny uspořádané ve stejném pořadí. Typická kresba kruhového bakteriálního chromozomu je jako hodiny od 0 do 100, přičemž geny jsou umístěny v příslušných pozicích na základě času, který je potřebný k jejich přenosu (v minutách). Toto je příklad syntenie, což je zachování pořadí genů podél chromozomu266. K synteny se brzy vrátíme.

Pokud je přenesena celá sekvence F-plazmidu, z původní F-buňky se stane Hfr buňka. Pokud Hfr buňka ztratí F-plazmidovou sekvenci, vrátí se do F-stavu. Konečný výsledek procesu konjugace je podobný tomu získanému při sexuální reprodukci u eukaryot (viz níže), konkrétně původní F-buňka má nyní genom odvozený částečně od ní samotné a od „dárcovské“ buňky kmene Hfr.


Pomocí hodnot Ka v tabulce 9.6 vypočítejte pH pufru, který obsahuje dané koncentrace slabé kyseliny a její konjugované báze. a. 0,55 M CH3COOH a 0,55 M NaCH3COO

Za použití KA hodnoty v tabulce 9.6, vypočítejte pH pufru, který obsahuje dané koncentrace slabé kyseliny a její konjugované báze.

a.0,55 M CH3COOH a 0,55 M NaCH3VRKAT

Buffer Slabá kyselina Konjugovaná báze KA
Kyselina octová/octan CH3COOH CH3COO - 1.8 × 10 − 5
Bikarbonát/karbonát HCO3 CO3 2 − 5.6 × 10 − 11
Dihydrogenfosfát/ hydrogenfosfát H2PO4 HPO4 2 − 6.2 × 10 − 8
Hydrogenfosfát/ fosfát HPO4 2 − PO4 3 − 2.2 × 10 − 13


Materiály|metody

Buňky z B. truncatella byly získány od Carolina Biological Supply Company (Burlington, NC, USA) a jejich buňky C. magna byly získány z American Type Culture Collection (#50128). Klonální kultury byly založeny a pěstovány ve vodě Volvic s pšeničnými zrny a Klebsiella sp. B. truncatella včetně kultur Paramecium sp. Jednotlivé buňky byly odebrány pipetou a promyty třikrát ve sterilizované vodě Volvic, poté ponechány hladovět po dobu 48 hodin. Deset hladovějících buněk z každého druhu bylo jednotlivě celý genom amplifikováno pomocí REPLI-g Mini Kit (Hilden, Německo) podle pokynů výrobce. Pro každý druh bylo deset celogenomových amplifikovaných produktů kombinováno ve stejných koncentracích DNA.

Zesílená DNA z B. truncatella byl sekvenován pomocí chemie Illumina MiSeq v2 (13 288 644 čtení 2 × 250 bp) a chemie Illumina HiSeq v3 113 546 269 čtení 2 × 150 bp). Amplifikovaná DNA z C. magna byl sekvenován pomocí chemie MiSeq v3 (18 770 554 2 × 300 bp čtení) a HiSeq v3 chemie (28 298 554 2 × 150 bp čtení). Protože velikosti genomu těchto dvou druhů nejsou známy, nemohli jsme odhadnout pokrytí sekvenováním. Optimální délka k-meru pro sestavení genomu byla hledána v rozmezí 21–201 pomocí KmerGenie v1.6976 (Chikhi a Medvedev 2014) pomocí parametru „diploid“. Genomy byly poté sestaveny pomocí Minia v2.0.7 (Chikhi a Rizk 2012), přičemž minimální množství kmeru bylo 5. Získané kontigy byly poté analyzovány pomocí AUGUSTUS v2.7 (Stanke et al. 2004) na strukturální anotaci, pomocí následujícího parametry: vyhledávání na obou vláknech genomu je částečné předpovídání genů nezávisle na každém řetězci, umožnění překrývajících se genů na opačných vláknech hlásí transkripty s druhy zastavovacích kodonů v rámci nastavenými na ciliate T. thermophila. Čtení byla uložena do archivu čtení sekvencí GenBank pod čísly BioProject PRJNA381863 a PRJNA382551.

Byla vytvořena vyhledávací databáze 11 genů specifických pro meiózu a 40 genů souvisejících s meiózou z ciliate a nonciliatních eukaryot pomocí literatury a vyhledávání klíčových slov v databázi proteinů NCBI bylo převzato z Chi et al. (2014a). Pro REC8 jsme použili kanonické eukaryotické sekvence a T. thermophilaJe nekanonický REC8 (Howard-Till a kol. 2013). ORF dvou kolpodů byly prohledány pomocí databáze dotazů pomocí BlastP (Altschul a kol. 1990) a HMMER v3.0 (Eddy 2001). Hity s E-hodnoty <10 -4 pro celou sekvenci byly zachovány. Ověření kandidátních homologů využívalo reciproční vyhledávání BlastP proti neredundantní databázi proteinových sekvencí NCBI (doplňkové soubory 1 a 2, doplňkový materiál online).

Abychom určili sílu purifikační selekce působící na inventarizované meiotické geny, změřili jsme ω = dN/dS, počet nesynonymních substitucí na nesynonymní místo dělený počtem synonymních substitucí na synonymní místo. Sekvence generované z této studie byly sladěny s homologními sekvencemi identifikovanými z T. thermophila, P. tetraurelia, Ichthyophthirius multifiliis, a Oxytricha trifallax od Chi et al. (2014a). Sekvence byly zarovnány v Geneious v4.8.3 (Kearse et al. 2012) pomocí Translation Align with ClustalW v2 (Larkin et al. 2007). Sekvence, které se dostatečně nepřekrývaly s jinými geny, byly nezařaditelné nebo bylo zjištěno, že jsou paralogní s geny z těchto jiných druhů, byly vyloučeny z další analýzy (doplňková tabulka 1, doplňkový materiál online). Genealogie maximální pravděpodobnosti každého genu byly odvozeny s MEGA7 (Kumar et al. 2016) a četnost synonymních a nesynonymních substanic byla odhadnuta pomocí PAML v4.8 (Yang 2007). ω bylo nejprve vypočteno mezi B. truncatella a C. magna. Poté byly zahrnuty všechny druhy, aby se otestovalo, zda počet řádků vede k C. magna vykazovaly vyšší hodnoty ω, což by se dalo očekávat, pokud by tyto geny již nebyly funkční a tedy zažívaly uvolněnou selekci. Pomocí codeml jsme porovnali model evoluce s jednou hodnotou ω pro celý strom (model = 0) s modelem, kde C. magna linie měla samostatnou hodnotu ω (model = 2). K určení, zda druhý model poskytoval výrazně lepší přizpůsobení dat, byl použit test poměru pravděpodobnosti log.


Coccolithophores jako např Emiliania Huxleyiová zde jsou zobrazeny jednobuněčné mořské fytoplanktony, které produkují váhy uhličitanu vápenatého (coccoliths). Vyskytují se ve všech světových oceánech a společně představují největší zdroj biogenního uhličitanu vápenatého na Zemi, který významně přispívá ke globálnímu uhlíkovému cyklu. Coccoliths, které jsou produkovány uvnitř buněk, jsou vylučovány na povrch buňky. Objev protonových kanálů v buněčné membráně coccolithophore poskytuje nový pohled na to, jak se vyrovnávají s nadbytečnými protony generovanými během kalcifikace, a bude informovat budoucí studie o tom, jak tyto důležité organismy budou reagovat na okyselování oceánů (viz Taylor et al., E1001085).

Obrazový kredit: Alison R. Taylor (Microscopy Facility University of North Carolina Wilmington)

Citace: (2011) PLoS biologie Obrázek vydání | sv. 9 (6) Červen 2011. PLoS Biol 9 (6): ev09.i06. https://doi.org/10.1371/image.pbio.v09.i06

Zveřejněno: 28. června 2011

Autorská práva: © 2011 Taylor. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný za podmínek licence Creative Commons Attribution License, která umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu za předpokladu, že je uveden původní autor a zdroj.


Základní ionizační konstanta, Kb

Základní ionizační konstanta (Kb) - rovnovážná konstanta pro ionizaci báze také nazývaná disociační konstanta báze .

Obecná rovnice pro reakci báze, B, s vodou:

B (aq) + H2O (l) ⇌ BH + (aq) + OH - (aq)

Bronsted-Lowryho báze reagují s vodou za vzniku OH - (aq) iontů a konjugované kyseliny, které společně určují acidobazické vlastnosti vodného roztoku.

Slabé základy, jako slabé kyseliny, tvoří dynamické rovnováhy ve vodných roztocích.

Pro reakci generické báze s vodou je rovnice zákona o rovnováze K napsána takto:

Protože koncentrace (hustota) vody je konstanta, lze ji zahrnout do hodnoty K (stejně jako tomu bylo v rovnici zákona rovnováhy pro KA).

Tím se získá nová konstanta, Kb, volal báze ionizační konstanta:

Slabé báze jsou konjugované báze slabých kyselin.

Například etanoátový iont, C2H3Ó2 - (aq), je konjugovaná báze kyseliny ethanové, HC2H3Ó2 (aq). Podobně je chlornanový iont, ClO - (aq), konjugovanou bází pro kyselinu chlornou, HClO (aq).


Praktické tipy ELISA

Enzymově vázané imunologické testy (ELISA) kombinují specificitu protilátek s citlivostí jednoduchých enzymatických testů pomocí protilátek nebo antigenů spojených se snadno testovatelným enzymem. Testy ELISA mohou poskytnout užitečné měření koncentrace antigenu nebo protilátky. Jako jeden z nejcitlivějších imunotestů nabízí ELISA komerční hodnotu v laboratorním výzkumu, diagnostice biomarkerů onemocnění a kontrole kvality v různých průmyslových odvětvích.

Podle metody detekce analytu existují různé typy ELISA. Každý z nich má svůj vlastní protokol, ale základní princip je podobný. ELISA je obecně pětistupňový postup:
1) Antigenní povlak
2) Blokování všech nenavázaných míst, aby se zabránilo nespecifické absorpci
3) Přidejte analyt a inkubujte
4) Přidejte značenou protilátku a inkubujte
5) Přidejte činidla pro barvení/ luminiscenci, čímž získáte pozitivní výsledek.

Formát ELISA a obecný protokol jsme již probrali v ELISA Guide a ELISA Development Guide. Zde diskutujeme hlavně o některých základních znalostech a praktických radách během provozního procesu ELISA. Pokud potřebujete více informací o komerčních soupravách ELISA, navštivte náš produkt soupravy ELISA.

2. Deska ELISA (pevná fáze)

Existují různé typy pevné fáze, které lze použít pro ELISA, jako je membrána, destička s jamkami a kuličky. Jejich charakterizace je popsána v následující tabulce 1.

Tabulka 1. Typy pevných fází imunoanalýzy

Materiala Vazebná kapacita Typ interakce
Membrána
Nitrocelulóza
PVDF
Nylon

Vysoký
Vysoký
Vysoký

Hydrofobní, hydrofilní
Hydrofobní
Hydrofobní
Desky a trubky
Polystyren
Polyvinyl

Nízký
Nízký

Hydrofobní
Hydrofobní
Korálky
Polystyren
Derivatizovaný polystyren
Mikročástice

Mírný
Vysoký
Vysoký

Hydrofobní
Kovalentní, hydrofobní, hydrofilní
Kovalentní a hydrofobní

Nejčastěji se testy ELISA provádějí v 96-jamkových (nebo 384-jamkových) destičkách. Většina desek je buď polystyren, nebo deriváty polystyrenu získané chemickou úpravou nebo ozařováním povrchu. Záchytný protein může být buď pasivně absorbován na povrchu polystyrenové desky nebo kovalentně spojen prostřednictvím modifikací, které zanechávají na povrchu aminové nebo reaktivní skupiny, jako jsou maleimidové, hydrazinové nebo N-oxysukcinimidové skupiny (obrázek 1). Právě tato vazba a imobilizace reagencií umožňuje ELISA tak snadno navrhnout a provést. Imobilizace reaktantů testu ELISA na povrch mikrodestičky umožňuje snadné oddělení navázaného a nenavázaného materiálu během testu. Tato schopnost odplavovat nespecificky vázané materiály činí z ELISA účinný nástroj pro měření specifických analytů v surovém přípravku.

Obrázek 1. Chemie povrchu polystyrenové desky a imobilizovaného proteinu.

Polystyren bude vázat rostoucí množství proteinů ve vzrůstajícím množství v závislosti na jejich koncentraci v potahovacím roztoku. Pro každý protein je potřeba určit konkrétní a optimální množství. Sacharidy a silně glykosylované proteiny se špatně adsorbují na polystyren výše popsanými silami, protože mají velmi malou schopnost podílet se na hydrofobních interakcích. Aby bylo možné tyto molekuly přilnout, musíme se uchýlit ke kovalentním vazbám.

Na povrchu polystyrenu byla provedena řada modifikací, které umožňují kovalentní propojení molekul s plastovým povrchem (obrázek 1c). Maleimidové skupiny reagují se sulfhydrylem za vzniku kovalentního spojení mezi plastovým povrchem a proteinem nebo peptidem. Hydrazin reaguje s aldehydy generovanými jodistanovou oxidací sacharidů. N-Hydroxysukcinimid (NHS) reaguje s aminy na peptidech nebo proteinech. Peptidy buď přes COOH konec použitím zesíťovacího činidla, jako je karbodiimid, nebo prostřednictvím aminu použitím homobifunkčního zesíťovacího činidla, jako je disuccinimidyl suberát (DSS). Tabulka 2 ukazuje doporučený způsob imobilizace různých antigenů na polystyrenové plotně.

Tabulka 2. Různé antigeny a jejich doporučená imobilizační metoda.

Přímá adsorpce Kovalentní vazba
Bílkoviny
Peptidy delší než 15-20 aminokyselin
Epitopy malých molekul připojené k proteinu
Bakterie a viry
Silně glykosylované proteiny
Bílkoviny v přítomnosti detergentů
Sacharidy
Krátké peptidy
Lipidy
DNA

3. Antigenní povlak

Klíčovým rysem testu ELISA na destičce je, že záchytný protein (protilátka nebo antigen) může být snadno připojen k povrchům pasivní adsorpcí nebo kovalentní vazbou. Tento proces se běžně nazývá potahování. Proces potahování antigenem ovlivňuje více faktorů. Míra a rozsah povlaku většinou závisí na následujících faktorech:
? Difúzní koeficient vazebné molekuly
? Poměr potahované plochy k objemu potahovacího roztoku
? Koncentrace adsorbovaného antigenu
? Teplota
? Doba adsorpce

Tyto faktory spolu souvisí. Nejdůležitější je stanovit optimální koncentraci povlaku antigenu pro každý systém. Čas a teplota jsou také důležité faktory ovlivňující množství adsorbovaného proteinu. Rozsah koncentrací 1–10 μg/ml proteinu v objemu 50–100 µL je dobrým vodítkem k hladině bílkovin potřebných k nasycení dostupných míst na polystyrenové plotně. Běžně používané potahovací roztoky jsou: 50 mM uhličitan, pH 9,6, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5 a 10 mM PBS, pH 7,2. Nejdůkladnější adsorpce a nejnižší variace mezi jamkami nastává přes noc (16–18 hodin) při 4 °C s utěsněnými jamkami, aby se zabránilo odpařování. Adsorpční čas lze urychlit inkubací při pokojové teplotě po dobu 4–8 hodin nebo 37 ° C po dobu 1–4 hodin. Existuje mnoho dalších variací a nakonec každý vědec musí titrovat konkrétní antigen, aby získal standardizovaný režim. Po procesu potahování nezapomeňte odstranit potahovací roztok a promyjte destičku tak, že naplníte jamky 200 μl PBS na 3x. Poté odstraňte promývací roztoky jemným překlápěním desky přes umyvadlo. Odstraňte všechny zbývající kapky poklepáním talíře na papírovou utěrku.

S jakýmikoli potížemi s potahováním antigenu navštivte naši službu Microplate Coating Service nebo požádejte o bezplatného konzultanta našich specialistů.

4. Blokovací proces

Potažení jamek specifickým vazebným partnerem, buď antigenem nebo protilátkou, zanechává na plastu neobsazená hydrofobní místa. Tato místa musí být blokována, aby se zabránilo nespecifické vazbě následných reaktantů. Pokud to není účinně dosaženo, bude test trpět vysokým signálem pozadí a sníženou specificitou a citlivostí (obrázek 2). Tyto blokátory fungují tak, že snižují nespecifickou vazbu a zvyšují poměr signálu k šumu. Aby se zabránilo nespecifické vazbě, po kroku potahování v pevné fázi se používají blokovací pufry, aby se zablokovala všechna zbývající otevřená vazebná místa.

Blokovací činidla se obvykle volí empirickým způsobem. Optimální blokátor pro jeden test nemusí fungovat dobře v jiných testech. Dvě hlavní třídy blokovacích činidel, které byly testovány, jsou proteiny a detergenty.

Obrázek 2. Destička ELISA s procesem blokování a bez něj.

Detergenty se dělí do tří tříd: neiontové, iontové a zwitteriontové. Nedoporučuje se používat jako blokátory iontové ani zwitteriontové, protože narušují hydrofobní interakce, které vážou proteiny potažené povrchem plastu. Detergenty používané jako blokovací činidla jsou obvykle neiontové, jako je Tween 20 a Triton X-100. Detergenty jsou považovány za dočasné blokátory, které neposkytují trvalou bariéru pro připojení biomolekul k povrchu, protože jejich blokovací schopnost lze odstranit promytím vodou nebo vodným pufrem. Na rozdíl od neiontových detergentů jsou proteiny trvalé blokátory a je třeba je přidat pouze jednou poté, co je povrch potažen záchytnou molekulou. Některé z nejčastěji používaných blokátorů proteinů jsou uvedeny v tabulce 3 a jejich výhody a nevýhody.

Tabulka 3. Výhody a nevýhody běžně používaných blokátorů proteinů.

Ideální blokovací činidla mají následující vlastnosti:
? Účinně blokuje nespecifickou vazbu testovacích reaktantů na povrch jamky
? Nerušte vazbu složek testu, které byly adsorbovány do jamky
? Působí jako stabilizátor (zabraňuje denaturaci) testovacích reaktantů na pevné fázi
? Nereagujte zkříženě s jinými reaktanty testu
? Nemají enzymatickou aktivitu, která by mohla přispívat ke generování signálu substrátu nebo degradaci reaktantů
? Provádějte důsledně napříč různými šaržemi

5. Příprava protilátek

Protože protilátky jsou základním kamenem testu ELISA, výběr protilátek má samozřejmě prvořadý význam. Nejčastějším problémem je, jak vybrat protilátku, monoklon (MAb) nebo polyklon (PAb)? Obecně je MAb často vybrána jako primární protilátka pro stanovení nejvyšší úrovně specificity v testu a PAb je vybrána jako sekundární protilátka, aby se zesílil signál prostřednictvím vícenásobných vazebných událostí. Lze však použít libovolnou kombinaci. Všechny kandidátní protilátky musí být testovány společně se zamýšleným typem vzorku, aby bylo možné vybrat ty nejlepší.

Primární/sekundární protilátka by měla být zředěna v blokovacím roztoku, aby se zabránilo nespecifické vazbě. Obvykle stačí koncentrace 0,1-1,0 μg/ml.

Potřebujete vysoce kvalitní značenou protilátku, podívejte se na naši službu označování vlastních protilátek.

Potřebujete páry protilátek pro sendvičovou ELISA, zjistěte více o službě vývoje párů shodných protilátek.

Tabulka 4. Klíčové rozdíly ve výkonu mezi MAb a PAb

Monoklonální protilátky (MAb) Polyklonální protilátky (PAb)
A. Obecně produkované u myší nebo rekombinantně, tyto protilátky rozpoznávají jeden epitop.
b. Protože se k antigenu může vázat pouze jedna molekula protilátky, interakce je vysoce specifická, ale může postrádat citlivost.
A. Vyrábí se u koz, ovcí, kuřat, králíků a dalších zvířat.
b. Polyklonální séra jsou heterogepneózní kompozity protilátek s jedinečnými specifitami a koncentrace specifické protilátky (PAb) je typicky 50-200 mg/ml.
C. PAbs jsou schopny rozpoznat více epitopů na jakémkoli antigenu, což je činí méně citlivými na změny mutace antigenu.
d. PAb jsou užitečné, když povaha antigenu není dobře známá. Jejich množství je však omezeno délkou života zvířete.

6. Příprava vzorku

Vzorky obsahují hlavní analyty, které potřebujeme detekovat pomocí ELISA. Vynikající příprava roztoku vzorku může zlepšit kvalitu testu ELISA. Typ vzorku může být rozmanitý, jako je sérum, plazma, moč, buněčné nebo tkáňové lyzáty, sliny, mléko, supernatant buněčné kultury atd. Každý vzorek může vyžadovat specifický proces přípravy. Obecný protokol pro přípravu vzorků je následující:
A. Koncentrace proteinového extraktu je alespoň 1-2 mg/ml.
b. Buněčné a tkáňové extrakty se zředí o 50 % vazebným pufrem.
C. Vzorky se odstřeďují při 10 000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut při 4 °C, aby se před použitím odstranila jakákoli sraženina.

Podrobnosti o každém vzorku naleznete v tabulce 5.

Tabulka 5 Běžně používané typy vzorků ELISA a jejich ošetření.

Vzorky Léčba
Sérum Odeberte plnou krev do zkumavky bez přísad Uchovávejte při pokojové teplotě po dobu 20 minut. Centrifugujte 10 minut při 3 000 ot./min. Alikvóty do malých zkumavek a skladujte při -80°C až do použití. Minimalizujte cykly zmrazení/rozmrazení.
Plazma Odeberte plnou krev do EDTA, citrátové nebo sodné heparinové zkumavky Odstřeďte 10 minut při 3 000 ot / min při 4 ° C alikvotujte do malých zkumavek a skladujte při -80 ° C až do použití. Minimalizujte cykly zmrazování/rozmrazování.
Moč Odebírejte moč bez přidání stabilizátorů. Vzorky silně odstřeďte (např. 10 000 x g po dobu 1 minuty nebo 5 000 x g po dobu 2 minut). Alikvot, rychle zmrazit v lázni suchý led/methanol a skladovat při -80 °C až do použití.
Sliny Odeberte vzorky a centrifugujte při 10 000 x g po dobu 2 minut při 4 °C. Alikvotujte supernatant a vzorky uložte při -80 °C. Minimalizujte cykly zmrazení/rozmrazení.
Buněčné lyzáty Umístěte destičky pro tkáňové kultury na led. Vyjměte médium a jednou jemně promyjte buňky ledově vychlazeným PBS. Odeberte PBS a přidejte 0,5 ml extrakčního pufru na 100 mm destičku. Nakloňte destičku a seškrábněte buňky do předem vychlazené zkumavky. Krátce vortexujte a inkubujte na ledu 15-30 minut. Centrifugujte při 13 000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut při 4 °C (tím se vytvoří peleta z nerozpustného obsahu). Alikvotujte supernatant do čistých, chlazených zkumavek (na ledu) a vzorky skladujte při -80 ° C, vyhýbejte se cyklům zmrazení/rozmrazení.
Tkáňové lyzáty Vypreparujte požadovanou tkáň čistými nástroji, nejlépe na ledu a co nejrychleji, aby se zabránilo degradaci proteázami. Umístěte tkáň do mikrocentrifugačních zkumavek s kulatým dnem a ponořte je do tekutého dusíku, aby „rychle zamrzly“. Vzorky skladujte při -80 ° C pro pozdější použití nebo uchovávejte na ledu pro okamžitou homogenizaci. Pro

7. Roztok pufru

V testu ELISA se používá 5 hlavně pufrovacích roztoků: potahovací pufr, blokovací pufr, promývací pufr, substrátový pufr a zastavovací pufr.

Potahovací pufr obvykle 0,05 M uhličitanový pufr s pH = 9,6.

Potahovací pufr Blokovací vyrovnávací paměť Promývací pufr Vyrovnávací paměť substrátu Zastavit vyrovnávací paměť
Uhličitanový pufr 0,05M, pH = 9,6 Viz tabulka 3 0,01 M PBS-Tween 20, pH = 7,4 Pufr kyselina fosforečná, pH=5,0 2M H2TAK4
Na2CO3 1,59 g NaCl 8 g 0,2M Na2HPO4 25,7 ml
NaHCO3 2,93 g KH2PO4 0,5 g 0,1M kyselina citrónová 24,3 ml
ddH2Ó 1000 ml Na2HPO4 2,9 g ddH2Ó 50 ml
upravte pH na 9,6 Tween 20 0,5 ml OPD (substrát) 4mg
skladování při 4 ° C ddH2O přidejte do 1000 ml 30% H2Ó2 0,015 ml

8. Kroky praní

Inkubace, které se provádějí v testu ELISA, umožňují vznik vysoce afinitních specifických interakcí mezi reaktanty. Několikrát promytím mezi každou inkubací se přebytečné reakční složky zředí na nedetekovatelnou úroveň pozadí. Aby se přebytečné reaktanty účinně zředily, je nutné po každé inkubaci promýt 3–5krát. Je také dobré nechat 5 až 10 minut namočit promývací pufr v každém kroku promývání. Pokud se promývací kroky provádějí ručně, vyklepejte přebytečný promývací pufr v každém kroku tak, že destičku utřete dnem vzhůru do suchých papírových ručníků. Nenechte destičku delší dobu schnout mezi kroky promývání, protože to může vést ke snížení aktivity.

9. Analýza dat

Test ELISA poskytuje tři různé typy výstupu dat:

? Kvantitativní: Údaje ELISA lze interpretovat ve srovnání se standardní křivkou (sériové ředění známého, čištěného antigenu), aby bylo možné přesně vypočítat koncentrace antigenu v různých vzorcích.
? Kvalitativní: ELISA lze také použít k dosažení odpovědi ano nebo ne, která indikuje, zda je ve vzorku přítomen konkrétní antigen, ve srovnání s prázdnou jamkou neobsahující žádný antigen nebo nesouvisející kontrolní antigen.
? Semikvantitativní: Testy ELISA lze použít ke srovnání relativních hladin antigenu v testovaných vzorcích, protože intenzita signálu se bude přímo měnit podle koncentrace antigenu.

Data ELISA jsou typicky grafována s optickou hustotou vs log koncentrací za vzniku sigmoidální křivky. Známé koncentrace antigenu se použijí k vytvoření standardní křivky a poté se tato data použijí k měření koncentrace neznámých vzorků porovnáním s lineární částí standardní křivky (obrázek 3).


Metody

Antigeny

Albumin z hovězího séra (BSA) byl přírodní purifikovaný protein získaný od společnosti Fluka, USA. Surový jed kobry (Naja Kaouthia) a zelená pit zmije (Trimeresurus albolabris) byly zakoupeny od Thajské společnosti červeného kříže v Thajsku. Aflatoxin B1-BSA konjugovaný a rozpustný aflatoxin B1 (Sigma, Německo) byly připraveny z Aspergillus flavus. Amylázový enzym typu XII-A (Sigma, Německo) byl připraven z Bacillus licheniformis. Purified Chick Embryo Cell (PCEC) vakcína proti vzteklině kmen flury LEP (Chiron Behring, Indie) byly inaktivované viry vztekliny, které byly kultivovány v primárních kuřecích fibroblastových buňkách. Cholangiokarcinom, buněčná linie (KKU-100), která je prokázána vajíčkem Opisthorchis-asociovaný cholangiokarcinom pocházející z porta jaterních buněk [68] byl darem od Dr. Banchob Sripa.

Konstrukce pModl fagemidového vektoru

Vektor Phage 3.2 (Maxim Biotech Inc, USA) byl použit jako základ pro konstrukci vektoru fagemid pMod1. Nový vektor obsahuje SfiJá a NeOmezuji weby a zahrnuji hexahistidinový tag a Myc tag. Dva oligonukleotidy, Mod1up (5' TCG ACC CAT GGC TCG AGG CGG CCG CAC ATC ATC ATC ACC ATC ACG GGG CCG CAG GGC C 3') a Mod1dn (5' CT GCG GCC CCG TGA TGG TGA TGA TGA GCCC AGTC GCG CAT GGG 3') byly hybridizovány a ligovány do vektoru fága 3.2 (obrázek 1) pro vytvoření pModl. Vložení bylo provedeno v Apajá/SalI místa pomocí T4 DNA ligázy (NEB, USA). Hotový vektor pModl byl amplifikován transformací E-coli DH5aF 'a fagemidová DNA byla připravena pomocí soupravy pro extrakci miniprep (Qiagen, Německo). Integrita plazmidu byla potvrzena automatickou analýzou sekvence DNA (Macrogen, Korea).

Konstrukce lidské fágové knihovny scFv

Generování scFv genového repertoáru

Dary periferní krve od sto čtyřiceti zdravých, neimunizovaných dárců byly shromážděny do čtyř skupin podle různých krevních skupin. Tyto krevní vzorky byly testovány s negativním výsledkem a byly propuštěny z jednotky dárcovství krve Thajské společnosti Červeného kříže v provincii Nakhon Ratchasima. Celková RNA byla připravena z B lymfocytů a sloučena dohromady. Přibližně 2 ml vzorků krve od každého dárce byly odebrány do čtyř skupin podle různých krevních skupin (krevní skupina A, B, O a AB). Bylo tedy použito celkem přibližně 280 ml vzorku krve. B-lymfocyty byly izolovány z periferní krve pomocí Ficollova plakového činidla (Amersham, USA). Stručně řečeno, zředěný vzorek krve (1: 1 krve na PBS) byl opatrně navrstven na Ficollův plakový reagent a poté byl dvoufázový roztok centrifugován při 400 x G po dobu 30 minut. B-lymfocyty byly odebrány z rozhraní mezi oběma fázemi. Kontaminace rozhraní, jako jsou krevní destičky a plazmatické proteiny, byly odstraněny promytím PBS. Celková RNA byla extrahována z B-lymfocytů činidlem TRIzol (Invitrogen, USA). B-lymfocyty byly resuspendovány v 1 ml TRIzolu a inkubovány při 65 ° C po dobu 15 minut za občasného převrácení zkumavky. Po přidání 0,2 ml chloroformu byla zkumavka vortexována po dobu 15 sekund a poté odstřeďována při 12 000 x G 15 minut při 4 ° C. Vodná fáze byla přenesena do nové zkumavky obsahující 1 μl RnaseOut (40 U/μl, Invitrogen, USA) a k vysrážení RNA bylo přidáno 0,5 ml isopropanolu. Zkumavka byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 10 minut. Vysrážená RNA byla peletována centrifugací při 12 000 x G po dobu 15 minut při 4 °C. Peleta byla promyta 0,5 ml 75% ethanolu a poté odstředěna při 12 000 x G 15 minut při 4 ° C. Poté, co byl supernatant odstraněn, byla peleta sušena na vzduchu po dobu 5 minut při teplotě místnosti a rozpuštěna ve sterilní deionizované vodě. Poté byl 1 ul RnaseOut (40 U/ul, Invitrogen, USA) přidán do celkové RNA a skladován při -70 °C. První vlákno cDNA bylo vytvořeno z 10 μg celkové RNA pomocí MMuLV reverzní transkriptázy (NEB, USA) se směsí 20 μM oligo-dT18 a 8 ng náhodného hexamerového primeru. Geny pro variabilní oblasti těžkého řetězce, K lehkého řetězce a A lehkého řetězce (VH, V.κa Vλ) byly amplifikovány odděleně a rekombinovány třemi následnými reakcemi PCR. První sada PCR se skládá ze 75 nezávislých reakcí pro vytvoření variabilních domén těžkého a lehkého řetězce. 5' primery těžkého řetězce byly navrženy tak, aby zahrnovaly a SfiI místo a 3' primery lehkého řetězce zahrnují a NeI stránky. 5 'primery lehkého řetězce byly navrženy tak, aby zahrnovaly část oblasti linkeru (Gly4Ser)3 a kompatibilní s 3' primery těžkého řetězce (tabulka 1). Každý gen variabilní oblasti byl samostatně amplifikován pomocí horkého startu PCR v reakci 50 ul obsahující 5 ul cDNA a 1 uM každého 5 'a 3' primeru. Tato reakce byla provedena za použití Taq polymerázy (NEB, USA). Vzorky byly zahřívány při 94 ° C po dobu 5 minut, poté následovalo 35 cyklů při 94 ° C po dobu 1 minuty, 55–65 ° C po dobu 1 minuty, 72 ° C po dobu 2 minut. Konečné prodloužení bylo provedeno při 72 °C po dobu 10 minut. Stejné množství produktů PCR bylo spojeno do sbírek VH, Vκa Vλ genový repertoár, a purifikován z agarózového gelu s nízkou teplotou tání podle standardního protokolu [69]. Ve druhé PCR byly těžké a lehké řetězce sestaveny a amplifikovány pomocí pfu DNA polymeráza (Promaga, USA). Sestavovací PCR reakce obsahovala stejnou molární směs poolovaného těžkého (V.H) DNA a spojené světlo (Vκ, nebo Vλ) genový repertoár. Sestavovací reakce byla 5krát cyklována (94 °C po dobu 45 s, 60 °C po dobu 50 s a 72 °C po dobu 60 s) bez primerů. Třetí reakcí byl vytvořen kompletní genový repertoár scFv z druhé PCR pomocí PCR amplifikace v přítomnosti protahovacích primerů. Tato PCR rozšířila gen scFv z SfiJá a NeI místa lemující geny scFv, za použití následujících primerů: PTfw (5'-CCT TTC TAT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC-3 ') a PTrv (5'-CAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG-3'). Reakce byla provedena za použití Taq polymerázy a 1 μl sestavených produktů z druhé PCR. Tato průchozí PCR byla cyklována 30krát (94 ° C po dobu 1 minuty, 60 ° C po dobu 1 minuty, 72 ° C po dobu 2 minut) a konečné prodloužení při 72 ° C po dobu 10 minut. Poté byly vzorky purifikovány pomocí QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Německo) pro další krok.

Klonování scFv do vektoru pModl

Amplifikovaná scFv DNA a pModl fagemidový vektor byly postupně štěpeny NeJá a SfiI, inkubací za vhodných podmínek po dobu 10 hodin. Rozřezaný vektor byl poté defosforylován telecí střevní fosfatázou (NEB, USA) a před ligací byl čištěn na gelu pomocí Wizard® DNA Clean-Up System (Promega, USA). Celkem 2,8 ug štěpené scFv DNA bylo ligováno do 5,5 ug pModl fagemidového vektoru v molárním poměru vektor: insert 1:3, aby se vytvořila fúzní knihovna scFv-gen III. Ligace byla provedena pomocí T4 DNA ligázy (NEB, USA) přes noc při 16 ° C. Populace ligované DNA byly elektroporovány do Escherichia coli (E-coli) TG1 (Maxim Biotech Inc, USA) pomocí elektroporátoru Eppendrof 2510 (Eppendrof, USA). Transformované buňky byly poté inkubovány po dobu 1 hodiny při 37 °C před nanesením na TYE destičku obsahující ampicilin (100 ug/ml) a glukózu (1 % w/v), destička byla inkubována přes noc při 37 °C. Complexity of the library was determined at this step by serially diluting the transformed cells and counting the number of colonies. Ligation efficiency was also determined by counting the number of colonies from no-insert ligation. Colonies were then collected, mixed with glycerol, and stored at -80°C. The library stock was grown to log phase and rescued with M13KO7 helper phage (Maxim Biotech Inc, USA). Recombinant phage preparations were purified and concentrated by polyethylene glycol (PEG) precipitation before keeping at -80°C.

Determination of library size

A total of 8.3 μg of DNA was electroporated in to E-coli TG1 to generate the scFv phage library. After electroporation the cuvette was flushed with 6 ml of SOC medium and transformed cells were incubated for 1 hour at 37°C before spreading on TYE plate containing ampicillin (100 μg/mL) and glucose (1% w/v), then the plate was incubated overnight at 37°C. Complexity of the library was determined by serially diluting the transformed cells and counting the number of colonies. A volume of 100 μl from transformation reactions was taken and a four step 10-fold serial dilution was made. The 100 μl of each dilution was plated out. The appearance of 250 individual colonies from 10 4 dilution titer indicated a library diversity of 1.5 × 10 8 .

Selection of phage antibody library

Selection of phage particles displaying specific scFv fragments were performed on Immuno 96 MicroWell™ Plates (Nunc, Denmark). The different protein antigens (50–600 μg/ml) in phosphate-buffered saline (PBS) (or 0.1 mM NaHCO3, in case of amylase) were coated on the plates overnight at 4°C (in case of Rabies, the preparation was first incubated at 37°C for 2 hrs). For cholangiocarcinoma cell surface, approximately 5 × 10 5 cells growing in a 5-ml flask was used. Following blocking with 2% (w/v) skimmed milk powder in PBS (2% MPBS), a library containing between 10 11 and 10 12 phage particles were added and the plate was incubated for 2 hours at room temperature (RT 25–28°C). Non-bound phages were eliminated by washing 10–20 times with PBS containing 0.1% Tween 20 (PBS-T), followed by 10–20 times washing with PBS. The bound phages were eluted by incubation with 50 μl of 1 μg/μl trypsin for 10 min, followed by 50 μl of 50 mM glycine- HCl pH 2.0 (immediately neutralized with 50 μl of 200 mM NaHPO4, pH7.5 after 10 min). Eluted phages were used to infect exponentially growing E-coli TG1 cells by incubating for 30 min at 37°C. Infected cells were spread on TYE plate containing ampicillin (100 μg/mL) and glucose (1% w/v), then the plate was incubated overnight at 37°C. Individual phage-infected colonies were picked and grown for production of phagemid particles in 96-well plate. The culture was rescued using either M13KO7 or KM13 helper phage (MRC HGMP Resource Centre, Cambridge, UK) as describe elsewhere [55]. Rescued phage particles were used to test their antigen recognition properties by ELISA or to initiate subsequent rounds of selection using the similar conditions. Between one and two rounds of selection were performed for each antigen.

ELISA screening of selected clones

In order to detect antigen recognition, Immuno 96 MicroWell™ Plates were coated with approximately 5–200 μg/ml of each antigen. For cholangiocarcinoma, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde in 96-well tissue culture plate. After overnight incubation at 4°C, plates were blocked with 2% MPBS for 1 hour at RT followed by three washes with PBS. The selected phage preparation was diluted 1:2 in 4% MPBS before adding into each well, and incubated for 1 hour at RT. The plates were washed three times with PBS-T, followed by three times with PBS, and incubated with a 1:5,000 dilution of a mouse anti-M13 phage-horseradish peroxidase (HRP) conjugate (Amersham-Pharmacia Biotech, Sweden) in 2% MPBS. The plates were washed again as described earlier. The ABTS (2,2-azino-di-3-ethyl-benzthiazoine-6-sulfonate) peroxidase substrate (Fluka, USA) was added, and the absorbance was read at 405 nm, using a Sunrise absorbance reader (TECAN, Austria).

Inhibition ELISA

The inhibition ELISA was performed as described in the normal ELISA method, except that the phage particles were pre-incubated in the presence of increasing amount of soluble Aflatoxin B1 from 0.039–5.0 μg/ml.

DNA fingerprint analysis and DNA sequencing

The diversity of the selected scFv clones was analyzed by comparing restriction enzyme digestion patterns, a procedure called DNA fingerprinting. The scFv sequence of individual clones was amplified by PCR using the following primers: PTfw (5'-CCT TTC TAT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC-3') and PTrv (5'-CAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG-3'). The amplified product was digested with a frequent cutting enzyme, BstNI (NEB, USA) and analyzed on 2% agarose gels. For DNA sequencing, plasmid DNA from different clones was purified using MiniPreps kit (QIAGEN, Germany) and the inserts were sequenced using the dideoxynucleotide chain-termination method with -96gIII primer (5'-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'), corresponding to the vector sequence downstream of the scFv gene. After the amino acid sequences were translated, they were analyzed by using IgBLAST [36] and V BASE [34] software.

Soluble scFv antibodies production

E-coli HB2151 (Maxim Biotech Inc, USA) cells carrying the phagemid encoding the scFv antibody were grown in 10 ml of 2 × TY medium containing ampicillin (100 μg/mL) and glucose (1% w/v). After reaching an OD600 of 0.9, cells were harvested and grown at 30°C in glucose free 2 × TY medium containing 100 μg/mL ampicillin and 0.1 mM isopropyl-μ-d-thiogalactopyranoside (IPTG). The cell culture supernatant containing scFv were collected after induction for 20 hours. In some case, the cell lysate containing scFv were extracted after induction for 6 hours.


Absolute Quantification of Drug Vector Delivery to the Cytosol

Macromolecular drugs inefficiently cross membranes to reach their cytosolic targets. They require drug delivery vectors to facilitate their translocation across the plasma membrane or escape from endosomes. Optimization of these vectors has however been hindered by the difficulty to accurately measure cytosolic arrival. We have developed an exceptionally sensitive and robust assay for the relative or absolute quantification of this step. The assay is based on benzylguanine and biotin modifications on a drug delivery vector of interest, which allow, respectively, for selective covalent capture in the cytosol with a SNAP-tag fusion protein and for quantification at picomolar sensitivity. The assay was validated by determining the absolute numbers of cytosolic molecules for two drug delivery vectors: the B-subunit of Shiga toxin and the cell-penetrating peptide TAT. We expect this assay to favor delivery vector optimization and the understanding of the enigmatic translocation process.

Biological macromolecules such as peptides, proteins or oligonucleotides hold great therapeutic potential. They enable indeed to target “undruggable” proteins which lack cavities for small molecule binding, or to stimulate the immune system by antigen cross-presentation. However, macromolecules do not readily cross membranes. Most remain trapped at the plasma membrane or in intracellular compartments and do not reach their targets in the cytosol. Cytosolic arrival, via direct translocation across the plasma membrane or endocytosis followed by endosomal escape, is currently one of the main bottlenecks for the development of new macromolecular therapeutics. 1-3

For the optimization of cytosolic delivery, the process must be quantified. 4 Existing assays for this have a number of limitations, including the failure to distinguish between cytosolic versus intraluminal localizations and a lack of sensitivity and robustness (Table S1). Of note, two recently developed assays, the Chloroalkane Penetration Assay 5 and the NanoClick assay 6 rely on the HaloTag protein, 7 which covalently reacts to chloroalkanes. The cytosolic localization of the HaloTag reporter protein ensures the cytosolic specificity of the assay. Both assays measure the non-reacted reporter protein fraction, which is inversely proportional to the extent of translocated molecules. This limits the assay sensitivity. Furthermore, these assays do not provide absolute quantification of translocated molecules. Therefore, the quantification of small amounts of molecules reaching the cytosol remains challenging.

The example of siRNAs for the downregulation of disease-related proteins might be chosen to illustrate this point. For an efficient therapeutical effect, it is estimated that 2000–4000 siRNA molecules need to reach the cytosol per cell. 8, 9 The sensitivity of a cytosolic arrival assay is thus essential to detect such low numbers of molecules per cell and to optimize existing or develop new delivery tools.

To address this challenge, we have designed the Cyto-SNAP assay. This assay is based on a cytosolic capture protein assembled from SNAP-tag and mNeonGreen. The SNAP-tag reacts covalently with the small molecule benzylguanine (BG). 10 A vector of interest (e.g., protein- or peptide-based drug delivery tools) modified with BG will react with the SNAP-tag only if the vector reaches the cytosol (Figure 1 a).

A robust, sensitive, and quantitative cytosolic arrival assay. a) Schematic representation of the Cyto-SNAP assay. Upon membrane translocation, the BG-modified vector encounters the cytosolic mNeonGreen-SNAP-tag protein with which it reacts covalently. mNeonGreen is exploited for immunoprecipitation on beads coated with anti-mNeonGreen nanobodies, and the biotin moiety for ELISA. b) Parental, polyclonal mNeonGreen expressing (NG) or monoclonal mNeonGreen-SNAP-tag expressing (NG-SNAP) HeLa cell lines were treated with fluorescent SNAP-tag ligand BG-647-SiR. SiR fluorescence was only observed on NG-SNAP cells, in which it was homogeneously distributed in the cytosolic space. c) Demonstration of the high efficiency of the SNAP-tag reaction. Lysate from NG-SNAP cells was incubated with excess benzylguanine–biotin (BG–biotin) ligand, followed by streptavidin pull-down. Western blotting analysis showed that the cell lysate was depleted of mNeonGreen-SNAP-tag protein, which was indeed recovered on beads. d) Demonstration that the mNeonGreen immunoprecipitation (IP) is complete. The mNeonGreen-SNAP-tag protein was totally recovered on mNeonGreen-Trap beads, which confirmed the efficacy of the immunoprecipitation. e) Sensitivity and linearity of the assay. Known amounts of STxB-BG-biotin conjugate C were added into NG-SNAP cell lysate, followed by incubation at 37 °C, mNeonGreen-SNAP-tag immunoprecipitation and ELISA development. The obtained standard curve was linear over a wide range of concentrations. Even low picomolar STxB-BG-biotin concentrations were robustly detected. f) Demonstration that non-reacted SNAP-tag protein is efficiently quenched before cell lysis. Intact NG-SNAP and NG cells were incubated for 30 min at 4 °C or 37 °C in presence or absence (Ø) of SNAP-Cell® Block reagent. The cells were then washed, lysed, and lysates were incubated at 4 °C with or without STxB-BG-biotin conjugate A. Both 37 °C and 4 °C block conditions gave ELISA signals comparable to background signal without STxB-BG-biotin incubation.

mNeonGreen, 11 the second part of the cytosolic capture protein, is used for high affinity immunoprecipitation on beads coated with anti-mNeonGreen nanobodies (low Kd of 2 n m ). In this way, BG-tagged vector that reacts with the SNAP-tag of the cytosolic capture protein can be isolated. Finally, a biotin conjugated to the vector serves for quantification by ELISA (Figure S1).

We chose to validate the assay using two different vectors: i) Residues 47–57 from the HIV TAT protein, 12 which is one of the best-studied cell-penetrating peptides, and ii) the B-subunit of Shiga toxin (STxB), a vector for cancer cell targeting and immunotherapy. 13 After binding to its receptor, the glycosphingolipid Gb3, STxB is internalized and follows the retrograde transport route to the endoplasmic reticulum. STxB was shown to be able to translocate to the cytosol 14 and to efficiently deliver antigens for antigen cross-presentation, 13 making it an interesting model for a cytosolic arrival assay.

A monoclonal HeLa cell line, termed NG-SNAP, stably expressing the cytosolic mNeonGreen-SNAP-tag capture protein was generated for the assay. Diffuse mNeonGreen fluorescence and BG-fluorophore labeling were observed, which documented the expression of properly folded protein in the cytosol (Figure 1 b). To test whether the cytosolically localized mNeonGreen-SNAP-tag was fully functional, immunoprecipitation and pull-down experiments were performed against each of its two subunits: i) Lysates from NG-SNAP cells were incubated with an excess of BG–biotin, followed by streptavidin pull-down. This led to the complete depletion of mNeonGreen-SNAP-tag from the lysates, thereby proving that the SNAP-tag subunit was fully functional (Figure 1 c). ii) The same approach using anti-mNeonGreen nanobody beads also led to the depletion of mNeonGreen-SNAP-tag from the lysates, which further validated the functionality of the fusion protein (Figure 1 d). The combination of highly efficient SNAP-tag reaction and complete mNeonGreen immunoprecipitation laid the foundation for a fully quantitative assay.

Linearity and sensitivity are key parameters of a quantitative assay. To this end, low picomolar concentrations of BG- and biotin-tagged STxB were added to mNeonGreen-SNAP-tag-containing cell lysate, and incubated at 37 °C to allow for BG-SNAP-tag reaction. Subsequent mNeonGreen immunoprecipitation and ELISA development resulted in a linear standard curve, which documented the exquisite sensitivity of the assay (Figure 1 e).

Importantly, on cells, using a membrane-permeable BG-derivative, it was possible to quench non-reacted SNAP-tag prior to lysis (Figure 1 f). In the real assay format, this step is required to avoid post-lysis reaction between non-cytosolic BG-tagged vector and non-conjugated SNAP-tag in the lysate. Finally, STxB showed normal intracellular trafficking in NG-SNAP cells and in cells stably expressing mNeonGreen in the absence of SNAP-tag (termed NG cells), which were used as controls (Figure S2). All these findings qualified the engineered NG-SNAP and NG cell lines for the Cyto-SNAP assay.

The Cyto-SNAP assay (Figure S3) was first used to provide relative quantifications of cytosolic arrival between different conditions (incubation times, vector concentrations or inhibitor treatments). STxB (Figure 2 a,b) and TAT (Figure 2 g,h) translocation to the cytosol increased in a time- and concentration-dependent manner. For STxB, the translocation signal started to plateau at concentrations above 100 n m (Figure 2 b and S4a), while TAT translocation continued to increase exponentially beyond at least 20 μ m (Figure 2 h and S4b), suggesting that the process was receptor-independent for TAT, and receptor-dependent for STxB. Depletion of the STxB receptor, glycosphingolipid Gb3, by incubation of NG-SNAP cells with a glucosylceramide synthase inhibitor indeed reduced the cytosolic arrival of STxB to background level (Figure 2 c). Background was defined throughout all experiments as ELISA signal observed from NG cells. STxB translocation to the cytosol was also greatly impacted when incubations were performed at low temperatures, i.e., 4 °C or 19.5 °C (Figure 2 d). This observation was likely caused by changes in membrane organization leading to the disappearance of domain boundaries at which membranes are more permeable. 15, 16 In ATP depleted cells, STxB arrival in the cytosol was also strongly decreased (Figure 2 e). As for the 4 °C condition, endocytosis of STxB is inhibited in ATP-depleted cells. 17 Thus, it can be concluded that cellular entry is required for efficient translocation to the cytosol. The arrival of STxB in the cytosol was also found to be partially reduced when endosomal acidification was inhibited (Figure 2 f). Finally, TAT was compared to TAT-PEG6-GFWFG, previously reported to have an enhanced capacity to translocate to the cytosol. 18 We found no difference in cytosolic arrival at concentrations below 10 μ m (Figure 2 i). In contrast, TAT-PEG6-GFWFG translocated much more efficiently than TAT at concentrations above 15 μ m (Figure 2 i). TAT undergoes endocytosis at low concentrations, whereas at concentrations above 10 μ m direct translocation across the plasma membrane becomes the dominant mechanism (ref. 19 for a review, see ref. 20 ). It therefore appears likely that the strongly enhanced cytosolic arrival of TAT-PEG6-GFWFG at concentrations above 15 μ m resulted from direct translocation across the plasma membrane. These results qualified the Cyto-SNAP assay for membrane translocation measurements with different types of vectors.

Relative quantifications of STxB and TAT translocation to the cytosol, using the Cyto-SNAP assay on NG-SNAP cells. In all experiments, NG cells served as background controls. The cytosolic signal is expressed as percentage of the maximum signal obtained in each individual replicate experiment. a) Time dependency. Cells were incubated with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A for 0, 4, or 24 h (continuous incubation). The cytosolic signal increased with time. b) Concentration dependency. Cells were incubated for 4 h with STxB-BG-biotin conjugate A at the indicated concentrations. The cytosolic signal increased with concentration. c) Glycosphingolipid dependency. Cells were pre-treated or not for 5 days with the glycosylceramide synthase inhibitor Genz-123346, and then incubated for 4 h with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A. The translocation process to the cytosol was glycosphingolipid dependent. d) Temperature dependency. Cells were incubated for 4 h with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A at the indicated temperatures. Translocation to the cytosol was blocked at 4 °C and 19.5 °C. e) ATP dependency. Cells were incubated for 90 min with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A under ATP depletion conditions. Translocation to the cytosol was ATP dependent. f) Acidification dependency. Cells were incubated for 4 h with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A in the presence or absence of 100 n m of the V-ATPase inhibitor bafilomycin A1. Translocation to the cytosol was partly inhibited by bafilomycin A1 treatment. g) Time dependency of TAT translocation to the cytosol. Cells were incubated with 200 n m BG-biotin-TAT conjugate C for 0, 4, or 24 h (continuous incubation). The cytosolic signal increased with time. h) Concentration dependency of TAT translocation to the cytosol. Cells were incubated for 4 h with BG-biotin-TAT conjugate C at the indicated concentrations. The cytosolic signal increased with concentration. i) Comparison of TAT versus TAT-PEG6-GFWFG. NG-SNAP cells were incubated for 4 h at 37 °C with different concentrations of TAT or TAT-PEG6-GFWFG. Cytosolic signal is normalized to signal from 25 μ m TAT. TAT-PEG6-GFWFG has an increased cytosolic translocation capacity compared to TAT at concentrations above 15 μ m . Statistical analysis: two-tailed paired t-test * p<0.05 ** p<0.01 and *** p<0.001.

For absolute quantification of cytosolic arrival, the conjugation of BG and biotin reporter moieties was optimized in order to achieve 1:1 molar ratios of both BG and biotin per vector (or per monomer in the case of homopentameric STxB). We synthesized several scaffolds, comprising each BG, biotin, and maleimide for conjugation to the vectors (Scheme 1 and Figure S5–7). All STxB-based conjugates showed intracellular retrograde trafficking to the Golgi, as for non-modified STxB (Figure S8). With increasing PEG linker sizes, STxB conjugates C and D showed higher ELISA signal intensity when added directly in cell lysate (Figure 3 a). This was likely due to reduced steric hindrance for streptavidin binding to biotin on STxB pentamer whose BG had already reacted with the SNAP-tag. The same effect was not observed on the monomeric TAT (Figure 3 b). In contrast, cytosolic arrival was reduced for both STxB and TAT with the increased PEG linker size of scaffold D (Figure 3 c,d). An effect of long PEG linkers on cytosolic arrival was previously reported for the cell-penetrating peptide TAT-PEG-GWWG: PEG12 or PEG18 diminished the translocation efficiency when compared to PEG6. 18 In order to balance sensitivity and translocation efficiency, we chose to work with the maleimide-BG-biotin scaffold C. The resulting STxB conjugate C had a membrane translocation capacity similar to conjugate A, for which BG and biotin were separately coupled to STxB.

Evaluation of the different STxB and TAT conjugates for the Cyto-SNAP assay. a,b) Comparison of the ELISA signal obtained with the different STxB and TAT conjugates directly added into cell lysate. 40 p m of each STxB conjugate or 100 p m of each TAT conjugate were added to NG-SNAP cell lysate and incubated for 1 h at 37 °C for the SNAP reaction to occur before mNeonGreen immunoprecipitation and ELISA development on beads. c,d) Comparison of cytosolic arrival signal from the different STxB conjugates (40 n m ) or TAT conjugates (200 n m ) after 4 h incubation at 37 °C with NG or NG-SNAP HeLa cells.

Different strategies used for biotin and BG conjugation to vectors a) Biconjugation method: Use of commercial NHS ester—BG for conjugation to amines of the vector, and maleimide-biotin for conjugation to thiol. b–d) Monoconjugation method: Synthesized maleimide-benzylguanine-biotin molecules for conjugation to thiol of the vector. Different PEG linker sizes were tested in order to avoid steric hindrance between vector, the BG reaction with the SNAP-tag, and streptavidin binding to the biotin moiety.

The choice of lysis conditions was also critical for quantification to ensure that vectors are extracted from membranes with which they may remain associated even after translocation to the cytosolic compartment (see ref. 14 for STxB). We used high salt concentrations and sonication as recommended for TAT extraction, 21 and optimized the choice of detergent to achieve complete STxB extraction (Figure S9a). These conditions remained fully compatible with the requirement for SNAP-tag reaction and immunoprecipitation (Figure S9b,c).

For absolute quantification, a standard curve is essential. For this, we have devised a simple approach (Figure S10): Known amounts of BG and biotin-tagged vector were mixed into NG-SNAP cell lysate, leading to complete reaction with the SNAP-tag protein of the lysate. As shown in Figure 1 e, low picomolar sensitivity was reached with this approach. Using the standard curve, the amount of vector translocated to the cytosol and the total amount of vector associated with NG-SNAP cells were then determined (Figure S10). For the total cell-associated amount, the SNAP-tag quenching step was omitted, such that BG and biotin-tagged vector molecules fully reacted with unquenched SNAP-tag in the cell lysate. Of note, immunoprecipitation and subsequent ELISA steps were performed for all samples in parallel under identical conditions such that absorbance readings could be compared directly.


Bacterial Conjugation Steps

In order to transfer the F-plasmid, a donor cell and a recipient cell must first establish contact. At this point, when the cells establish contact, the F-plasmid in the donor cell is a double-stranded DNA molecule that forms a circular structure. The following steps allow the transfer of the F-plasmid from one bacterial cell to another:

Krok 1

The F + (donor) cell produces the pilus, which is a structure that projects out of the cell and begins contact with an F – (recipient) cell.

Krok 2

The pilus enables direct contact between the donor and the recipient cells.

Krok 3

Because the F-plasmid consists of a double-stranded DNA molecule forming a circular structure, i.e., it is attached on both ends, an enzyme (relaxase, or relaxosome when it forms a complex with other proteins) nicks one of the two DNA strands of the F-plasmid and this strand (also called T-strand) is transferred to the recipient cell.

Krok 4


Podívejte se na video: La norriture heterotrophe - Chapitre 1 - La biologie - - عبد الله رضا MD (Prosinec 2022).