Informace

Jsou některé polyketidy enzymy?

Jsou některé polyketidy enzymy?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Aktuálně čtu „knihu“ (spíše článek) s názvem „Protein Modeling & Molecular Docking: Modeller, Autodock“.

Abstrakt začíná následující větou:

Polyketidy jsou velkou rodinou komplexních enzymů syntetizovaných polyketid syntázami.

Před čtením tohoto článku jsem nevěděl nic o polyketidech. Podíval jsem se na to online a viděl jsem, že to byli sekundární metabolity, což je součet zbytku článku. Nemohl jsem však najít žádnou zmínku o tom, že by některé polyketidy byly enzymy, proto moje otázka:

Jsou některé polyketidy enzymy nebo je to jednoduchá chyba v článku?


Máte pravdu. Polyketid syntázy (PKS) jsou enzymy, které syntetizují polyketidy. PKS jsou odvozeny ze syntáz mastných kyselin evolucí. Polyketidy jsou velmi zajímavé, protože mnohé z nich mají důležité lékařské využití.


PKS lze rozdělit do tří skupin s následujícími pododděleními:

  • Polyketid syntázy typu I jsou velké, vysoce modulární proteiny.
    • Iterační PKS typu I opakovaně používají domény cyklicky.
      • NR-PKS-neredukující PKS, jejichž produkty jsou skutečné polyketidy
      • PR-PKS — částečné snížení PKS
      • FR-PKS-plně redukující PKS, jejichž produkty jsou deriváty mastných kyselin

      Každý modul polyketid-syntázy typu I se skládá z několika domén s definovanými funkcemi, oddělených krátkými mezerovými oblastmi. Pořadí modulů a domén kompletní polyketid-syntázy je následující (v pořadí N-konec až C-konec):

      • Začínající nebo načítání modul: AT-ACP-
      • Prodloužení nebo rozšiřující se moduly: -KS-AT- [DH-ER-KR] -ACP-
      • Ukončení nebo uvolňující doména: -TE
      • AT: Acyltransferáza
      • ACP: Acylový nosný protein se skupinou SH na kofaktoru, serinem vázaný 4'-fosfopantethein
      • KS: Ketosyntáza se skupinou SH na cysteinovém postranním řetězci
      • KR: Ketoreduktáza
      • DH: Dehydratáza
      • ER: Enoylreduktáza
      • MT: Methyltransferase O- nebo C- (α nebo β)
      • SH: PLP-dependentní cystein lyáza
      • TE: Thioesteráza

      Polyketidový řetězec a startovací skupiny jsou vázány svou karboxylovou funkční skupinou na SH skupiny ACP a KS domény thioesterovou vazbou: RC (= O) OH + HS-protein RC = RC (= O) S- protein + H2Ó.

      ACP nosné domény jsou podobné nosným doménám PCP nerribozomálních peptid syntetáz a některé proteiny kombinují oba typy modulů.

      Rostoucí řetězec je předáván z jedné thiolové skupiny do druhé trans-acylací a na konci se uvolňuje hydrolýzou nebo cyklizací (alkoholýza nebo aminolýza).

      • Startovací skupina, obvykle acetyl-CoA nebo jeho analogy, je načtena do ACP domény startovacího modulu katalyzována AT doménou startovacího modulu.
      • Polyketidový řetězec je předán z domény ACP předchozího modulu do domény KS aktuálního modulu, katalyzován doménou KS.
      • Elongační skupina, obvykle malonyl-CoA nebo methylmalonyl-CoA, je nanesena na aktuální doménu ACP katalyzovanou aktuální AT doménou.
      • ACP-vázaná elongační skupina reaguje v Claisenově kondenzaci s KS-vázaným polyketidovým řetězcem pod CO2 evoluce, zanechávající volnou KS doménu a ACP-vázaný prodloužený polyketidový řetězec. Reakce probíhá v KSn-svázaný konec řetězu, takže se řetěz posune o jednu pozici a z prodlužovací skupiny se stane nová vázaná skupina.
      • Volitelně může být fragment polyketidového řetězce pozměněn postupně dalšími doménami. KR (keto-reduktázová) doména redukuje β-ketoskupinu na β-hydroxyskupinu, DH (dehydratázová) doména odštěpuje H2O, což vede k a-p-nenasycenému alkenu, a doména ER (enoylreduktáza) redukuje a-p-dvojnou vazbu na jednoduchou vazbu. Je důležité si uvědomit, že tyto modifikační domény ve skutečnosti ovlivňují předchozí přidání do řetězce (tj. Skupinu přidanou v předchozím modulu), nikoli komponentu přijatou do domény ACP modulu obsahujícího modifikační doménu.
      • Tento cyklus se opakuje pro každý prodlužovací modul.

      Polyketid syntázy jsou důležitým zdrojem přirozeně se vyskytujících malých molekul používaných k chemoterapii. [3] Například mnoho z běžně používaných antibiotik, jako jsou tetracyklin a makrolidy, jsou vyráběny polyketid syntázami. Dalšími průmyslově důležitými polyketidy jsou sirolimus (imunosupresivum), erythromycin (antibiotikum), lovastatin (anticholesterolové léčivo) a epothilon B (protirakovinné léčivo). [4]

      Pouze asi 1% všech známých molekul jsou přírodní produkty, přesto bylo uznáno, že téměř dvě třetiny všech léků, které jsou v současné době používány, jsou alespoň částečně odvozeny z přírodního zdroje. [5] Tato předpojatost se běžně vysvětluje argumentem, že přírodní produkty se v prostředí vyvíjely po dlouhou dobu společně, a proto byly předem vybrány pro aktivní struktury. Polyketid syntázové produkty zahrnují lipidy s antibiotickými, protiplísňovými, protinádorovými a predátorskými obrannými vlastnostmi, nicméně mnohé z cest polyketid syntázy, které běžně používají bakterie, houby a rostliny, dosud nebyly charakterizovány. [6] [7] Byly proto vyvinuty metody pro detekci nových drah polyketid syntázy v prostředí. Molekulární důkazy podporují názor, že mnoho nových polyketidů zbývá objevit z bakteriálních zdrojů. [8] [9]


      Primární metabolismus lidských patogenních hub, význam pro virulenci a potenciál pro vývoj léčiv

      Jennifer Scott, Jorge Amich, v referenčním modulu v biomedicínských vědách, 2021

      Polyketidy

      Polyketidy jsou vzácným typem lipidů, běžně označovaných jako sekundární metabolity, které mají biosyntetickou chemii velmi podobnou mastným kyselinám (Smith a Tsai, 2007 Chiang et al., 2010). Tato různorodá skupina sloučenin má velký význam pro virulenci houbových patogenů. Zejména, Aspergillus druhy mohou produkovat mnoho polyketidů působením enzymů polyketid syntázy typu I s vysokým významem pro lidské zdraví (Bhetariya et al., 2011). Například, A. flavus a A. parasiticus produkují aflatoxin polyketidovou cestou sestávající z nejméně 27 reakcí, což je toxin, který kontaminuje potraviny a způsobuje hepatotoxicitu, teratogenitu a imunotoxicitu (Caceres et al., 2020 Kumar et al., 2017). Kromě toho, A. fumigatus produkuje (z přibližně 8 polyketidů) DHN-melanin, který pokrývá spory a o kterém je známo, že je velmi důležitým faktorem virulence plísní (Bignell et al., 2016 Heinekamp et al., 2013 Akoumianaki et al., 2016).


      Jsou některé polyketidové enzymy? - Biologie

      Polyketidy jsou třídou přírodních produktů izolovaných z mikrobů, rostlin a bezobratlých, která zahrnuje působivý počet klinicky účinných léčiv s různými aktivitami. Jmenujme několik příkladů: erythromycin (antibiotikum), rapamycin (imunosupresivum), amfotericin (antimykotikum), avermektin (antiparazitikum) a doxorubicin (protirakovina). Stejně jako ostatní přírodní produkty mohou polyketidy hrát v produkujících organismech různorodé role, od obranných zbraní (bránících růstu konkurentů nebo působících proti predátorům) až po signální molekuly (fungující jako poslové mezi sociálními organismy). U Mycobacterium tuberculosis jsou některé polyketidy klíčovými meziprodukty v syntéze komplexních lipidů. Tyto lipidy jsou důležitými složkami neobvykle tlustého buněčného obalu a pomáhají mikrobu stát se úspěšným patogenem. Studium syntézy polyketidů v této bakterii proto může vést k navržení specifických inhibitorů jako nových antimykobakteriálních léčiv.

      Polyketidy jsou produkovány postupnou kondenzací jednoduchých prekurzorů karboxylových kyselin, připomínající biosyntézu mastných kyselin. Tuto úlohu provádějí enzymy známé jako polyketid syntázy (PKS). Existuje několik typů PKS, od relativně jednoduchých proteinů po velké multienzymatické komplexy s desítkami katalytických míst. Používají kterýkoli ze dvou obecných mechanismů: (1) modulární —, ve kterém je každá sada katalytických míst použita pouze jednou během biosyntetického procesu, a (2) iterativní —, ve kterých je opakovaně použita stejná sada aktivních míst . Tento týden v PLoS Biology představuje Rajesh Gokhale a kolegové svůj výzkum zahrnující zvláštní PKS z M. tuberculosis. Protein PKS12 je kódován největším genem v genomu mikroba a podílí se na syntéze antigenního fosfoglykolipidu. Nejpozoruhodněji se zdá, že tento PKS využívá nový hybridní „modulárně iterativní“ mechanismus pro syntézu polyketidů. Několik molekul proteinu PKS12 se spojí a vytvoří supramolekulární celek, který provádí opakované cykly iterací. Sestava proteinu je tvořena specifickými mezimolekulárními interakcemi mezi N- a C-koncovými linkery. Tato studie poskytuje další příklad katalytické a mechanické univerzálnosti biosyntézy přírodních produktů PKS a#8212 je nevyčerpatelným zdrojem pro novou biochemii!

      Citace (otevřený přístup):
      Chopra T, Banerjee S, Gupta S, Yadav G, Anand S, Surolia A, Roy RP, Mohanty D, Gokhale RS (2008). Nový intermolekulární iterační mechanismus pro biosyntézu mykoketidu katalyzovanou bimodulární polyketidsyntázou. PLoS Biology 6 (7), e163. DOI: 10.1371/journal.pbio.0060163

      Obrázek: model proteinu PKS12, modifikovaný z obrázku 5 citovaného článku.

        . PLoS Biology (2004) 2(2): e35. (video vynikající přednášky Chaitana Khosly, květen 2007). iBioSeminars, Americká společnost pro buněčnou biologii. První část přednášky (Polyketidy a biosyntéza polyketidů) je také dostupná na Google Video a je vložena níže.

      Polyketidy jsou třídou přírodních produktů izolovaných z mikrobů, rostlin a bezobratlých, která zahrnuje působivý počet klinicky účinných léčiv s různými aktivitami. Jmenujme několik příkladů: erythromycin (antibiotikum), rapamycin (imunosupresivum), amfotericin (antimykotikum), avermektin (antiparazitikum) a doxorubicin (protirakovina). Stejně jako jiné přírodní produkty mohou polyketidy hrát různé role v produkujících organismech, od obranných zbraní (inhibujících růst konkurentů nebo působících proti predátorům) až po signální molekuly (fungující jako poslové mezi společenskými organismy). U Mycobacterium tuberculosis jsou některé polyketidy klíčovými meziprodukty v syntéze komplexních lipidů. Tyto lipidy jsou důležitými složkami neobvykle silného buněčného obalu a pomáhají mikrobu být úspěšným patogenem. Studium syntézy polyketidů v této bakterii proto může vést k navržení specifických inhibitorů jako nových antimykobakteriálních léčiv.

      Polyketidy jsou produkovány postupnou kondenzací jednoduchých prekurzorů karboxylových kyselin, připomínající biosyntézu mastných kyselin. Tuto úlohu provádějí enzymy známé jako polyketid syntázy (PKS). Existuje několik typů PKS, od relativně jednoduchých proteinů až po velké multienzymatické komplexy mající desítky katalytických míst. Používají kterýkoli ze dvou obecných mechanismů: (1) modulární —, ve kterém je každá sada katalytických míst během biosyntetického procesu použita pouze jednou, a (2) iterativní —, ve kterém se stejná sada aktivních míst používá opakovaně. . Tento týden v PLoS Biology Rajesh Gokhale a kolegové představují svůj výzkum týkající se zvláštního PKS z M. tuberculosis. Protein PKS12 je kódován největším genem v genomu mikroba a účastní se syntézy antigenního fosfoglykolipidu. Nejpozoruhodněji se zdá, že tento PKS využívá nový hybridní „modulárně iterativní“ mechanismus pro syntézu polyketidů. Několik molekul proteinu PKS12 se spojí a vytvoří supramolekulární sestavu, která provádí opakující se cykly iterací. Sestava proteinu je tvořena specifickými mezimolekulárními interakcemi mezi N- a C-koncovými linkery. Tato studie poskytuje další příklad katalytické a mechanické univerzálnosti biosyntézy přírodních produktů PKS a#8212 je nevyčerpatelným zdrojem pro novou biochemii!

      Citace (otevřený přístup):
      Chopra T, Banerjee S, Gupta S, Yadav G, Anand S, Surolia A, Roy RP, Mohanty D, Gokhale RS (2008). Nový intermolekulární iterační mechanismus pro biosyntézu mykketidu katalyzovaný bimodulární polyketid syntázou. PLoS Biology 6 (7), e163. DOI: 10.1371/journal.pbio.0060163

      Obrázek: model proteinu PKS12, modifikovaný z obrázku 5 citovaného článku.

        . PLoS Biology (2004) 2(2): e35. (video vynikající přednášky Chaitana Khosly, květen 2007). iBioSeminars, Americká společnost pro buněčnou biologii. První část přednášky (Polyketidy a polyketidová biosyntéza) je také k dispozici na Google Video a je vložena níže.


      Není-li uvedeno jinak, jsou blogové příspěvky Cesara Sancheze v Twisted Bacteria licencovány pod licencí Creative Commons Attribution 3.0 Unported License. Dejte mi prosím vědět, pokud jsou nějaké citace nebo obrázky na tomto blogu nesprávně uvedeny. E-mail: TwistedBacteria AT gmail DOT com. Ikony sociálních médií od Olivera Twardowského a AddThis.


      Metabolismus lipidů

      Jen velmi málo organismů produkuje tak různorodou řadu lipofilních molekul jako M. tuberculosis. Tyto molekuly se pohybují od jednoduchých mastných kyselin, jako je palmitát a tuberkulostearát, přes izoprenoidy, až po velmi složité molekuly s velmi dlouhým řetězcem, jako jsou kyseliny mykolové a fenolfthiocerolové alkoholy, které esterifikují kyselinou mykocerosovou za vzniku lešení pro připojení mykosidů. Mykobakterie obsahují příklady všech známých lipidových a polyketidových biosyntetických systémů, včetně enzymů obvykle nacházejících se v savcích a rostlinách, stejně jako běžných bakteriálních systémů. Biosyntetická kapacita je zastíněna ještě pozoruhodnějším zářením degradativních systémů oxidace mastných kyselin a celkem se v metabolismu mastných kyselin podílí ~ 250 různých enzymů. M. tuberculosis ve srovnání s pouhými 50 palci E-coli 20 .

      Degradace mastných kyselin. In vivo-vzhledem k rozmanitosti a množství lipidů dostupných v savčích buňkách a tuberkulóze 2 bylo naznačeno, že pěstované mykobakterie jsou z velké části lipolytické než lipogenní (obr. 4a). Hojnost genů kódujících složky systémů oxidace mastných kyselin nalezená naším genomovým přístupem podporuje tento návrh, protože existuje 36 acyl-CoA syntáz a rodina 36 příbuzných enzymů, které by mohly katalyzovat první krok degradace mastných kyselin. Existuje 21 homologních enzymů patřících do superrodiny enzymů enoyl-CoA hydratáza/izomeráza, které rehydratují vznikající produkt acyl-CoA dehydrogenázy. Čtyři enzymy, které převádějí 3-hydroxy-mastnou kyselinu na 3-keto-mastnou kyselinu, se zdají méně početné, hlavně proto, že je obtížné je odlišit od ostatních členů rodiny alkohol dehydrogenázy s krátkým řetězcem na základě primární sekvence. Pět enzymů, které dokončují cyklus thiolýzou β-ketoesteru, acetyl-CoA C-acetyltransferázy, se skutečně jeví jako omezenější rodina. Kromě této rozsáhlé sady disociovaných degradačních enzymů kóduje genom také kanonický β-oxidační komplex FadA/FadB (Rv0859 a Rv0860). Pro metabolismus lichých řetězců a množení nenasycených mastných kyselin jsou přítomny doplňkové činnosti.

      A, Degradace lipidů hostitelské buňky je životně důležitá v intracelulárním životě M. tuberculosis. Membrány hostitelských buněk poskytují prekurzory pro mnoho metabolických procesů, stejně jako potenciální prekurzory složek mykobakteriální buněčné stěny prostřednictvím působení široké rodiny beta-oxidačních enzymů kódovaných více kopiemi v genomu. Tyto enzymy produkují acetyl CoA, který může být přeměněn na mnoho různých metabolitů a palivo pro bakterie působením enzymů cyklu kyseliny citrónové a glyoxylátového zkratu tohoto cyklu. b, Mezi geny, které syntetizují mykolové kyseliny, dominantní lipidovou složku mykobakteriální buněčné stěny, patří syntáza mastných kyselin typu I (fas) a jedinečný systém typu II, který se spoléhá na prodloužení prekurzoru navázaného na protein acylového nosiče za vzniku mykolových kyselin s plnou délkou (~ 80 uhlíků). The cma geny jsou zodpovědné za cyklopropanaci. CGeny, které produkují fthiocerol dimycocerosát, tvoří velký operon a představují typ I (mas) a typu II ( pps operon) systémy polyketid syntázy. Funkce jsou barevně sladěny.

      Biosyntéza mastných kyselin. Na biosyntéze mastných kyselin v mykobakteriích se podílejí alespoň dva diskrétní typy enzymového systému, syntáza mastné kyseliny (FAS) I a FAS II (obr. 4b). FAS I (Rv2524, fas) je jediný polypeptid s mnohočetnými katalytickými aktivitami, který generuje několik kratších CoA esterů z acetyl-CoA primerů 5 a pravděpodobně vytváří prekurzory pro prodloužení všemi ostatními mastnými kyselinami a polyketidovými systémy. FAS II se skládá z disociovatelných složek enzymu, které působí na substrát navázaný na protein acylového nosiče (ACP). FAS II není schopen de novo syntéza mastných kyselin, ale místo toho prodlužuje palmitoyl-ACP na mastné kyseliny o délce od 24 do 56 uhlíků 17,21. Několik různých složek FAS II může být cílem pro důležitý lék na tuberkulózu isoniazid, včetně enoyl-ACP reduktázy InhA22, ketoacyl-ACP syntázy KasA a ACP AcpM21. Analýza genomu ukazuje, že existují pouze tři potenciální ketoacyl syntázy: KasA a KasB jsou velmi příbuzné a jejich geny se shlukují s acpMvzhledem k tomu, že KasC je vzdálenější homolog systému ketoacyl syntázy III. Počet genů ketoacyl syntázy a ACP naznačuje, že existuje jediný systém FAS II. Jeho genetická organizace se dvěma seskupenými ketoacyl syntázami se podobá genetickým klastrům biosyntetických genových klastrů aromatických polyketidů typu II, jako jsou ty pro aktinorhodin, tetracyklin a tetracenomycin v Streptomyces druh 23. InhA se zdá být jedinou enoyl-ACP reduktázou a její gen je transkribován společně s fabG homolog, který kóduje 3-oxoacyl-ACP reduktázu. Oba tyto proteiny jsou pravděpodobně důležité v biosyntéze mykolových kyselin.

      Mastné kyseliny se syntetizují z malonyl-CoA a prekurzory se generují enzymatickou karboxylací acetyl (nebo propionyl) -CoA biotin-dependentní karboxylázou (obr. 4b). Ze studia genomu předpovídáme, že existují tři kompletní karboxylázové systémy, z nichž každý se skládá z α- a β-podjednotky, stejně jako ze tří β-podjednotek bez α-protějšku. Jako skupina se zdá, že všechny karboxylázy jsou více příbuzné savčím homologům než odpovídajícím bakteriálním enzymům. Dva z těchto karboxylázových systémů (accA1, accD1 a accA2, accD2) se pravděpodobně podílejí na degradaci lichých mastných kyselin, protože sousedí s geny pro jiné známé degradační enzymy. Mohou převádět propionyl-CoA na sukcinyl-CoA, který pak může být začleněn do cyklu trikarboxylových kyselin. Syntetické karboxylázy (accA3, accD3, accD4, accD5 a accD6) jsou obtížněji pochopitelné. Tři další p-podjednotky mohou směrovat karboxylaci na příslušný prekurzor nebo mohou jednoduše zvýšit celkové množství dostupného karboxylovaného prekurzoru, pokud by tento krok omezoval rychlost.

      Po syntéze parafinického skeletu mastných a mykolových kyselin v buňce následují rozsáhlé postsyntetické modifikace a nenasycení, zejména v případě mykolových kyselin24,25. Nenasycení je katalyzováno buď FabA-podobnou beta-hydroxyacyl-ACP dehydrázou, působící se specifickou ketoacyl syntázou, nebo aerobní desaturázou se smíšenou funkcí na konci, která využívá jak molekulární kyslík, tak NADPH. Kontrola genomu neodhalila žádné zjevné kandidáty na aktivitu podobnou FabA. Nicméně tři potenciální aerobní desaturázy (kódované desA1, desA2 a desA3) byly evidentní, že vykazují malou podobnost s příbuznými enzymy obratlovců nebo kvasinek (které působí na estery CoA), ale místo toho připomínají rostlinné desaturázy (které používají estery ACP). V důsledku toho genomová data naznačují, že může dojít k nenasycení meromykolátového řetězce, zatímco je acylová skupina navázána na AcpM.

      Velká část následné strukturní diverzity v mykolových kyselinách je generována rodinou S-adenosyl-L-methionin-dependentní enzymy, které využívají nenasycenou kyselinu meromykolovou jako substrát pro tvorbu cís a trans cyklopropany a jiné mykoláty. Bylo identifikováno a charakterizováno šest členů této rodiny25 a v genomu jsou patrné dva shlukované, konvergentně transkribované nové geny ( umaA1 a umaA2). Z funkcí známých členů rodiny a struktur mykolových kyselin v M. tuberculosis, je lákavé spekulovat, že tyto nové enzymy mohou zavést trans cyklopropany na prekurzor meromykolátu. Kromě těchto dvou methyltransferáz existují ještě dvě další nesouvisející lipidové methyltransferázy (Ufa1 a Ufa2), které sdílejí homologii se syntázou cyklopropanové mastné kyseliny E-coli 25. Ačkoli se cyklopropanace jeví jako relativně běžná modifikace kyselin mykolových, cyklopropanace složek plazmatické membrány nebyla v mykobakteriích popsána. Tuberculostearová kyselina se vyrábí methylací kyseliny olejové a může být syntetizována jedním z těchto dvou enzymů.

      Kondenzace plně funkcionalizovaného a předem vytvořeného meromykolátového řetězce s 26-uhlíkovou a-větví generuje mykolové kyseliny o plné délce, které je nutné transportovat do jejich konečného umístění pro připojení k arabinogalaktanu buněčné stěny. Přenos a následná transesterifikace je zprostředkována třemi dobře známými imunogenními proteiny komplexu antigen 85 26. Genom kóduje čtvrtý člen tohoto komplexu, antigen 85C′ (fbpC2(Rv0129), který je vysoce příbuzný antigenu 85C. Jsou zapotřebí další studie, které by prokázaly, zda protein vykazuje aktivitu mykolytransferázy, a objasnily důvod zjevné nadbytečnosti.

      Syntéza polyketidů. Mykobakterie syntetizují polyketidy několika různými mechanismy. Modulární systém typu I, podobný systému zapojenému do biosyntézy erytromycinu 23, je kódován velmi velkým operonem, ppsABCDEa funguje při výrobě fenolfthiocerolu 5. Absence druhé polyketid syntázy typu I naznačuje, že příbuzné lipidy phthiocerol A a B, phthiodiolone A a phthiotriol mohou být všechny syntetizovány stejným systémem, buď z alternativních primerů nebo diferenciální postsyntetickou modifikací. Je fyziologicky významné, že pps shluk genů se vyskytuje bezprostředně před ním mas, který kóduje multifunkční enzym syntázu kyseliny mykocerosové (MAS), protože jejich produkty ftiocerol a kyselina mykocerosová esterifikují za vzniku velmi hojné molekuly ftthiocerol dimykocerosátu asociované s buněčnou stěnou (obr. 4c).

      Členové další velké skupiny enzymů polyketid syntázy jsou podobní MAS, která také generuje násobné složky rozvětvených mastných kyselin s methyl rozvětvenými mykosidy a dimthycocerosát phthiocerol, bohaté molekuly spojené s buněčnou stěnou 5. Ačkoli některé z těchto polyketid syntáz mohou rozšířit primery FAS CoA typu I na produkci dalších metylově rozvětvených mastných kyselin s dlouhým řetězcem, jako jsou mykolipenové, mykolipodienové a mykolipanolové kyseliny nebo kyseliny ftioceranové a hydroxyfthioceranové, nebo mohou dokonce vykazovat funkční překrývání 5, existuje mnoho více těchto enzymů než je známých metabolitů. Mohou tedy existovat nové lipidové a polyketidové metabolity, které jsou exprimovány pouze za určitých podmínek, například během infekce a nemoci.

      Čtvrtá třída polyketidsyntáz souvisí s nadrodinou rostlinných enzymů, která zahrnuje chalkon a stilbensyntázu23. Tyto polyketidsyntázy jsou fylogeneticky odlišné od všech ostatních polyketidových syntáz a syntáz mastných kyselin a vytvářejí neredukované polyketidy, které jsou typicky spojeny s anthokyanovými pigmenty a flavonoidy. Funkce těchto systémů, které jsou často spojeny se zdánlivými moduly typu I, není známa. Příkladem je klastr genů pks10, pks7, pks8 a pks9, který zahrnuje dva enzymy podobné chalkon-syntáze a dva moduly zjevného systému typu I. Neznámé metabolity produkované těmito enzymy jsou zajímavé kvůli silné biologické aktivitě některých polyketidů, jako je imunosupresor rapamycin.

      Siderofory. Peptidy, které nejsou syntetizovány ribozomálně, se vyrábějí způsobem, který je mechanicky analogický syntéze polyketidů 23, 27. Tyto peptidy zahrnují strukturně příbuzné siderofory pohlcující železo, mykobaktiny a exocheliny2,28, které jsou odvozeny od salicylátu přidáním serinu (nebo threoninu), dvou lysinů a různých mastných kyselin a možných polyketidových segmentů. The mbt za biosyntézu mykobakteriálních sideroforů může operon, kódující jeden zjevný salicylát aktivující protein, tři aminokyselinové ligázy a jeden modul polyketid syntázy typu I. Přítomnost pouze jednoho neribozomálního systému syntézy peptidů ukazuje, že tato dráha může generovat oba siderofory a že následná modifikace jedné e-aminoskupiny jednoho lysinového zbytku může odpovídat za různé fyzikální vlastnosti a funkci sideroforů28.


      Bakterie odolné vůči více lékům a pandrugům

      Již dlouho je známo, že mikroorganismy mají několik mechanismů lékové rezistence, které vyplývají z přirozeného výběru “genového fondu” neustále se vyvíjejících mikrobiálních populací buď genovými mutacemi (vertikální evoluce), nebo získáváním genů z jiných příbuzné druhy prostřednictvím mobilních genetických prvků, jako jsou plazmidy, fágy a transpozony (tj.horizontální přenos genů). Obrázek 3A ukazuje některé z hlavních mechanismů bakteriální rezistence na známá antibiotika. Historicky nevhodné použití farmakologických sloučenin v klinickém prostředí způsobilo umělý výběr mikrobioty, což urychlilo šíření rezistence mezi patogenními a komenzálními mikroorganismy. Jak je vidět na obrázku 3B, ke vzniku rezistentních patogenů v nemocničním prostředí obvykle dochází krátce po zavedení nové sloučeniny (Schmieder a Edwards, 2012).

      Mechanismy bakteriální rezistence na antibiotika (A) a vývoj rezistence na antibiotika ukazující rychlý vývoj rezistence na více tříd antibiotik (B). Reprodukováno z budoucí mikrobiologie, leden 2012, sv. 7, č. 1, strany 73 a#x0201389 se svolením společnosti Future Medicine Ltd. (Schmieder a Edwards, 2012).

      Navzdory této situaci vznik genů souvisejících s rezistencí na antibiotika předcházel klinickému používání antibiotik lidmi a neměl by být chápán jako výsledek tohoto výběru, ale jako jeho surovina. Mikrobiální rezistence vůči antibiotikům a patogenita nejsou moderní fenomény. Studie využívající vzorky metagenomické DNA extrahované z beringovských permafrostových sedimentů, které byly chráněny před kontaminací vrstvami vulkanické tefry (C 14 staré 30 000 let, patřící do pleistocénu) odhalily přítomnost několika genových shluků kódujících rezistenci vůči β-laktamu, tetracykliny, glykopeptidová antibiotika a přítomnost variant sekvencí podobných modernímu prvku rezistence na vankomycin VanA (D 𠆜osta a kol.(2011). To ukazuje přirozený průběh vzniku těchto genů evolucí, což naznačuje, že jejich role v antagonistických vztazích v mikrobiální komunitě předchází účinkům lidské činnosti.

      Jestliže neustálé přizpůsobování mikroorganismů lékům v oběhu vyžadovalo neustálé hledání nových formulací, pak vznik tříd multirezistentních bakterií učinil z objevu nových chemických molekul prioritu. Objevily se některé slibné přístupy, jako je vyhledávání v neprobádaných bakteriálních mezerách, vyhledávání databází syntetických molekul (Fischbach a Walsh, 2009) a využití metagenomiky.

      První třída odpovídá methicilin-rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA), a tato skupina je identifikována jako příčina 19 000 úmrtí ročně ve Spojených státech a každoročního nárůstu zdravotních nákladů řádově o 3 až 4 miliardy dolarů. Jako přitěžující faktor zvyšuje prevalence MRSA pravděpodobnost rezistence na vankomycin S. aureus (VRSA), dále náročná léčba nemocí v nemocnicích (Fischbach a Walsh, 2009).

      Druhá třída zahrnuje grampozitivní multirezistentní (MDR s rezistencí na některá léčiva) a na pandrug rezistentní (PDR s rezistencí na všechna léčiva) bakterie, které jsou méně rozšířené než MRSA, které však souvisejí s nevyléčitelnými klinickými obrazy. Kmeny Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneunominae, a Pseudomonas aeruginosa jsou MDR/PDR na penicilin, cefalosporin, karbapenem, monobaktam, chinolon, aminoglykosid, tetracyklin a polymyxin (Fischbach a Walsh, 2009).

      Třetí třídu tvoří Mycobacterium tuberculosis kmeny, které jsou MDR a jsou do značné míry rezistentní na léčiva (XDR), a jsou rostoucím problémem v rozvojových zemích, které vyžadují dvouletou léčbu antibiotiky, která způsobují závažné vedlejší účinky (Fischbach a Walsh, 2009).

      Tato situace vyvolává diskusi o zneužívání drog, které po celá léta urychluje tento proces rezistence, který je způsoben generacemi mikrobů, které se znovu objevují z léčby, která nemá dostatečné trvání ani dávku. Tato obava také vedla k vytvoření přísnějších pravidel pro nákup antibiotik, jako je nedávné rozhodnutí brazilské národní agentury pro dohled nad zdravím (Ag ência Nacional de Vigil ância Sanit ária - ANVISA) pro povinné předložení receptu koupit antibiotika, a tím omezit samoléčbu.


      II. Interakce protein-protein mezi AT a ACP v biosyntéze vicenistatinu

      AT jsou zodpovědné za výběr a začlenění acylových startovacích a extenderových jednotek do biosyntézy polyketidů. 22,) Proto by AT mohly být atraktivní cíle pro změnu specificity acylového stavebního bloku k získání biologicky aktivních nepřirozených analogů polyketidů. Avšak nahrazení AT domény homologní AT doménou mající odlišnou specifičnost vůči acylovému substrátu vedlo v mnoha případech ke snížení nebo zrušení produkce polyketidových analogů. 22,23) Bylo hlášeno, že AT rozpoznává svůj příbuzný ACP od jiných ACP prostřednictvím interakce protein -protein. 24,25 ) Správná interakce protein-protein mezi AT a ACP je tedy důležitá pro funkční přenos acylových skupin při biosyntéze polyketidů. Mechanismus rozpoznávání ACP však není dobře pochopen, protože strukturální určení komplexu AT – ACP je omezeno slabou a přechodnou interakcí mezi nimi. 26) Strukturální stanovení komplexu AT–ACP je nezbytné pro pochopení mechanismu rozpoznávání ACP během reakce přenosu acylu.

      Při biosyntéze vicenistatinu má VinK rozpoznávat VinL a VinP1LdACP z jiných ACP pro přenos dipeptidylové skupiny. Abychom vizualizovali interakci specifického proteinu s proteinem mezi VinK a dvěma ACP, pokusili jsme se kokrystalizovat VinK s VinL a VinP1LdACP. K zachycení přechodných komplexů VinK–ACP byla navržena metoda kovalentního zesíťování pomocí bifunkčního maleimidového činidla. 14,) Složitá struktura P450cam s redox partnerským putidaredoxinem byla stanovena dříve zachycením přechodného komplexu pomocí 1,6-bismaleimidohexanu. 27, ) V tomto případě byly povrchové zbytky těchto proteinů mutovány na Cys, což umožnilo místně specifické zesítění na jejich vazebném rozhraní. In VinK–ACP, a cross-link with the thiol group of the phosphopantetheine arm of ACP at the substrate-binding tunnel of VinK was proposed (Fig. 3(F)). For this purpose, a Cys mutation at Ser266 was introduced, which is located at the bottom of the substrate-binding tunnel in VinK. The cross-linking reaction between the VinK S266C mutant and VinL in the presence of 1,2-bismaleimidoethane (BMOE) gave a covalent complex, as expected. Finally, the VinK–VinL complex structure was determined successfully, which is the first crystal structure of an AT–ACP complex. 14 ) Similarly, the cross-linking reaction between the VinK S266C mutant and VinP1LdACP in the presence of BMOE gave a covalent complex however, obtaining a crystal of VinK–VinP1LdACP complex failed.

      In the VinK–VinL complex structure, the phosphopantetheine arm of VinL is orientated into the VinK substrate-binding pocket and covalently attached to the mutated Cys266 of VinK through BMOE (Fig. 3(G)). The binding interface between VinK and VinL comprises approximately 650 Å 2 . This small contact area is consistent with the transient nature of the AT–ACP interaction. VinK mainly recognizes the helix II region of VinL through salt bridges and hydrophobic interactions (Fig. 3(G)). Arg153 and Arg299 of VinK form salt bridges with Glu47 and Asp35 of VinL, respectively. Met206 of VinK forms hydrophobic contacts with Thr39, Leu43, Leu59, and Phe64 of VinL. VinK R153A, M206A, and R299A mutants showed significantly reduced affinities for VinL, confirming the importance of these VinK residues for the interaction with VinL. Based on the VinK–VinL complex structure, insight into the recognition mechanism of VinP1LdACP by VinK was also obtained. The VinK–VinL complex structure could be useful as a model for predicting the interaction of other AT–ACP complexes.

      Most ATs accept acyl-CoA as a substrate for transfer of the acyl group to the partner ACP. These acyl-CoA-specific ATs generally have an Arg or Lys residue near the entrance of the substrate-binding tunnel for interaction with the phosphate group of the ribose moiety of CoA. 15 , ) In contrast, VinK has a hydrophobic Met206 residue, which interacts with VinL residues, at the corresponding position. Other acyl-ACP-specific ATs such as ZmaA, 28 , ) ZmaF, 28 , ) and ClbG 29 ) also contain a hydrophobic residue at this position. Thus, the presence of a hydrophobic residue at this position might be a conserved feature in acyl-ACP-specific ATs.


      BIOSYNTHESIS OF NOVEL MOLECULES BY TYPE III PKSs THROUGH PRECURSOR-DIRECTED AND MUTAGENESIS APPROACHES

      Type III PKSs have been used for the synthesis of novel molecules because of their broad substrate specificity. Notably, incorporation of unnatural starter units has shown significance in generating new compounds. The BAS from R. palmatum catalyzes a simple decarboxylative condensation of malonyl-CoA with 4-coumaroyl-CoA. Taking advantage of its unusually broad substrate specificity and notable catalytic versatility, Wakimoto et al. synthesized a series of unnatural, novel tetramic acid derivatives by using aminoacyl-CoA thioesters as the starter units (Fig. 9). One of the tetramic acid products formed from D -phenylalanoyl-CoA showed moderate antiproliferative activity against murine leukemia P388 cells ( 46 ).

      Biosynthesis of novel cytotoxic tetramic acid derivatives by BAS.

      The structure-based mutagenesis of type III PKSs has been demonstrated to be a useful approach to engineering these enzymes and expanding the catalytic repertoire to produce larger and more complex polyketide molecules. As described above, the wild-type OKS from A. arborescens catalyzes the condensation of eight molecules of malonyl-CoA to produce the aromatic octaketides SEK4 and SEK4b (Fig. 2). The enzyme was first modified by a single mutation to generate the N222G mutant, which was able to produce a longer decaketide benzophenone SEK15 (Fig. 10A). Furthermore, the F66L/N222G double mutant was shown to produce dodecaketide TW95a by sequential condensation of 12 molecules of malonyl-CoA (Fig. 10B). A homology model predicted that the volume of the active-site cavity in the F66L/N222G mutant is increased to 748 Å, from 652 Å of the wild-type OKS ( 47 ), which explains why the longer polyketide can be synthesized.

      Engineered biosynthesis of long polyketides by OAS. (A) Biosynthesis of SEK15 by the N222G mutant of OAS. (B) Biosynthesis of TW95a by the F66L/N222G mutant of OAS.

      A recent work on HsPKS1 from Huperzia serrata has demonstrated that engineering of type III PKSs will not only lead to the synthesis of regular polyketides but also generate other types of molecules. HsPKS1 is similar to CHS, catalyzing the sequential condensation of 4-coumaroyl-CoA with three units of malonyl-CoA. However, HsPKS1 has an unusually broad substrate specificity, which allows the biosynthesis of unnatural unique polyketide-alkaloid hybrid molecules. This occurs via the condensation of nitrogen-containing substrates with two molecules of malonyl-CoA. The structure-based S348G mutant extended the product chain length and altered the cyclization mechanism. This is exemplified by the reactions in Fig. 11. HsPKS1 catalyzes the condensation of 2-carbamoylbenzoyl-CoA with two units of malonyl-CoA to generate 2-hydroxypyrido[2,1-A]isoindole-4,6-dione (Fig. 11A), whereas the S348G mutant takes three units of the extender units, yielding a biologically active alkaloid, 1,3-dihydroxy-5H-dibenzo[b,e]azepine-6,11-dioine (Fig. 11B) ( 48 ). An earlier research also reported the biosynthesis of 4-hydroxy-2(1H)-quinolones, a novel alkaloidal scaffold, by the BAS from R. palmatum s N-methylanthraniloyl-CoA and anthraniloyl-CoA as the starter units ( 49 ). These results have revealed that the use of nonphysiological substrates by type III PKSs may yield novel molecules.

      Biosynthesis of novel alkaloids by HsPKS1. (A) Biosynthesis of 2-hydroxypyrido[2,1-a]isoindole-4,6-dione by HsPKS1 from a unnatural starter unit, 2-carbamoylbenzoyl-CoA. (B) Engineered biosynthesis of 1,3-dihydroxy-5H-dibenzo[b,e]azepine-6,11-dioine by the S348G mutant of HsPKS1.

      Various type III PKSs have been engineered into E-coli to generate novel polyketides. The production of plant-specific curcuminoids has been reconstituted in E-coli by coexpressing CUS with phenylalanine ammonia-lyase from Rhodotorula rubra and 4-coumarate:CoA ligase (4CL) from Lithospermum erythrorhizon ( 50 ). Furthermore, the engineered strain was utilized to produce a series of unnatural curcuminoids by providing a variety of carboxylate precursors (Fig. 12) ( 51 ). Because of its broad substrate specificity, CUS has also recently been coexpressed with a 4CL from L. erythrorhizon, a fatty acid CoA ligase from O. sativa, and a β-oxidation system from S. cerevisiae to produce gingerol derivatives (Fig. 13) ( 52 ).


      Modularity of scaffold biosynthesis

      Initiation of biosynthesis

      The composition of the polyketide backbone, or scaffold, structure is governed by the stringency of acetyltransferase domains to load a specific acyl-CoA substrate, but also through substrate stereochemistry and redox pattern ( Sundermann a kol., 2013): each PKS assembles an individual product through the choice of acyl-CoA units, their level of reduction and subsequent tailoring. Initiation of scaffold biosynthesis requires selection and recruitment of a starter unit onto a didomain, comprising an acetyltransferase and an ACP, collectively termed the loading module. The resulting initial starter unit serves as the first substrate in the growth of the final β-keto-acyl chain. Generation of diversity through the promiscuity of acetyltransferase domains to load multiple different starter units, termed polyspecificity, is more commonly observed than by polyspecificity of extender modules later in biosynthesis ( McDaniel a kol., 1999 Yuzawa a kol., 2012). Introduction of diversity during initiation of biosynthesis also commonly occurs through the multiple different priming mechanisms used by the array of loading modules available ( Moore & Hertweck, 2002 Hertweck, 2009). Due to the mechanistic promiscuity of the starter domains, combinatorial biosynthesis attempts to manipulate PKS modules often start with here. For example, the acetyltransferase and ACP loading module of DEBS1 naturally recruit a propionate starter unit. Substitution with loading modules from tylosin and oleandomycin type I megasynthases from Streptomyces fradiae a Streptomyces antibioticus, respectively, resulted in controlled integration of propionate or acetate as a starter unit ( Long a kol., 2002). Similarly, the replacement of the isobutyryl-CoA-specific loading module initiating avermectin biosynthesis in Streptomyces avermitilis M1 by the unique phoslactomycin polyketide cyclohexanecarboxylic unit loading module from Streptomyces platensis resulted in production of the veterinary antiparasitic doramectin ( Wang a kol.(2011). Alteration of loading modules for the initiation of biosynthesis is therefore one step showing promise for the generation of novel polyketides.

      Chain extension

      After initiation, continued assembly of the polyketide scaffold requires loading of extender units onto the acetyltransferase and ACP and incorporation into the β-keto-acyl intermediate by the ketosynthase. At this stage, diversity can be introduced through the installation of noncanonical extender units resulting from the polyspecificity of loading domains, domain substitutions or by the iterative action of an otherwise modular PKS ( Kapur a kol., 2012). The collection of commonly used extender units nature provides is modest: Canonical extender units comprise malonyl- and methylmalonyl-CoA. Substitution for domains loading other, less commonly used, extender units will allow introduction of a broadened chemistry into the polyketide backbone. For example, reductive carboxylation of α,β-unsaturated acyl-CoA precursors via crotonyl-CoA reductase/carboxylase homologues facilitates inclusion of hexyl-, propyl-, chloroethyl- and isobutylmalonyl-CoA into the polyketide scaffold ( Eustaquio a kol., 2009 Liu a kol., 2009 Wilson a kol.(2011). Alternatively, functionalization of extender units on stand-alone ACPs allows the incorporation of allyl- ( Mo a kol., 2011), amino-, hydroxyl- ( Chan a kol., 2006) and methoxymalonyl-ACP ( Wu a kol., 2000) extender units into the polyketide scaffold.

      Predicting the polyspecificity of extender modules to introduce these rarer extender units is not straightforward. The mechanical processing and discrimination between acyl-CoA extender units by loading domains in type I modular PKSs is currently little understood. Investigations to elucidate why particular substrates are preferred or chosen are presenting a growing body of evidence suggesting that PKSs may be able to tolerate and incorporate exogenous natural and non-natural extender units into the β-keto-acyl chain. For example, analysis of the acyl-CoA substrate selectivity of PikAIV, a pikromycin synthase from Streptomyces venezuelae, elucidated the polyspecificity of extender modules towards substrates not readily present in the producer. PikAIV successfully loaded malonyl-, propionyl-, ethyl- and native methylmalonyl-CoA to the ACP. In the case of malonyl- and propionyl-CoA, active site occupancy was low at 3% and 19%, respectively. More interestingly, the rare extender ethylmalonyl-CoA showed acetyltransferase loading of 90% and low levels of hydrolytic release indicating its potential for incorporation during assembly the native substrate methylmalonyl-CoA showed 100% acetyltransferase saturation ( Bonnett a kol.(2011). In the case of PikAIV, all acyl-CoA substrates were loaded however, incorporation into the carbon chain depended upon the rate of subsequent hydrolytic release. These findings suggest that extender modules may show a greater tolerance to incorporate exogenous precursors lacking evolved selectivity, consistent with findings previously reported ( Pohl a kol.(2001). Substituting extender domains for the addition of novel extender units showing limited hydrolytic release could therefore result in the generation of novel polyketides however, no concrete rules defining what properties extender modules require to do so have been elucidated, despite observed discrimination between sizes of extender units and incorporation.

      Product release

      Manipulating starter and extender modules of PKSs may permit the introduction of novel acyl-CoA substrates into the polyketide scaffold. However, for these to show activity, they must be released from the PKS. For successful release, it is important to identify which catalytic domains act as decision gates, thereby permitting continuation of downstream biosynthesis of altered β-keto-acyl intermediates. Elucidating such points will significantly aid success when engineering BGCs. Yeh a kol. (2013) experimentally indicated that the phylogeny between nonreducing iterative PKS (nrPKS) modules is a good predictor of successful polyketide assembly and release from engineered BGCs. Increased phylogenetic proximity between gene units translated to improved domain–domain interactions and as a result, improved the release of the polyketide end product. In contrast, Xu a kol. (2013) show for type II nrPKSs that the best predictors of thioesterase acceptance, and therefore release, are the shape and size of the polyketide substrate and consequently indicate the stringency of thioesterase domains in carrying out discriminative decision gate functions. For example, if the native substrate of a thioesterase was a nonaketide, but the engineered assembly line presented it with a heptaketide, the rate of release was almost zero ( Vagstad a kol., 2013). Substituting thioesterase domains often resulted in abolished product formation, despite the presence of an abundance of β-keto-acyl intermediates produced by the upstream domains, whereas judicious choices of thioesterase substitution resulted in the successful production of an unnatural polyketide product, radilarin ( Xu a kol., 2013). Successful polyketide release from thioesterase in the case of resorcyclic acid lactones and dihydroxyphenylacetate acid lactones may be dependent upon substrate size ( Xu a kol., 2013). However, contrastingly, truncation of the DEBS1–3 megasynthase through relocation of the thioesterase domains downstream of the modular DEBS1 resulted in assembly and successful release of a much shortened triketide lactone ( Kao a kol., 1995 Pfeifer a kol.(2001). These contrasting results indicated the complex nature of the thioesterase and show the requirement for further work to build rules to predict thioesterase domain tolerance for substrates. Currently, for successful incorporation of novel starter and extender units, and successful product release, analysis of domains must be carried out on a case-by-case basis.


      Allergens/Antigens, toxins and polyketides of important Aspergillus species

      The medical, agricultural and biotechnological importance of the primitive eukaryotic microorganisms, the Fungi was recognized way back in 1920. Among various groups of fungi, the Aspergillus species are studied in great detail using advances in genomics and proteomics to unravel biological and molecular mechanisms in these fungi. Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nidulans and Aspergillus terreus are some of the important species relevant to human, agricultural and biotechnological applications. The potential of Aspergillus species to produce highly diversified complex biomolecules such as multifunctional proteins (allergens, antigens, enzymes) and polyketides is fascinating and demands greater insight into the understanding of these fungal species for application to human health. Recently a regulator gene for secondary metabolites, LaeA has been identified. Gene mining based on LaeA has facilitated new metabolites with antimicrobial activity such as emericellamides and antitumor activity such as terrequinone A from A. nidulans. Immunoproteomic approach was reported for identification of few novel allergens for A. fumigatus. In this context, the review is focused on recent developments in allergens, antigens, structural and functional diversity of the polyketide synthases that produce polyketides of pharmaceutical and biological importance. Possible antifungal drug targets for development of effective antifungal drugs and new strategies for development of molecular diagnostics are considered.

      Klíčová slova: Allergens Aspergillus species Polyketides.

      Postavy

      Antifungal drugs and the mechanism…

      Antifungal drugs and the mechanism of action

      Lovastatin nonaketide synthase(LovB) of Aspergilllus…

      Lovastatin nonaketide synthase(LovB) of Aspergilllus terreus showing general Aspergillus Polyketide synthase domain Architect…


      Podívejte se na video: Exercises (Červenec 2022).


Komentáře:

  1. Nisr

    Jak se vám daří psát tak zajímavé texty?

  2. Andreo

    Congratulations, your idea brilliantly

  3. Sekani

    I think you have been misled.

  4. Ganos

    Souhlasím, pozoruhodná zpráva

  5. Dihn

    Omlouvám se, ale tohle mi nesedí. Kdo jiný může dýchat?

  6. Marshal

    Zjišťuji, že nemáte pravdu. Jsem si jistý. Probereme to. Napište PM, domluvíme se.

  7. Ingelbert

    Rád přijímám.

  8. Dujas

    Slyšel jsem něco takového, ale ne tak podrobně, ale odkud jsi vzal materiál?



Napište zprávu