Informace

Signalizace prostřednictvím receptorů spojených s G proteinem?

Signalizace prostřednictvím receptorů spojených s G proteinem?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Existují dvě různé buněčné linie, ale nevíme, že tyto buněčné linie mají Gs nebo Gi proteiny spojené s jejich receptory spojenými s G-proteinem. Pokud o tom chceme vědět. Můžeme navrhnout experiment, jehož prostřednictvím bychom byli schopni identifikovat specifické Gs nebo Gi proteiny v buněčných liniích?


Bez experimenty jsou příliš obtížné a nákladné, nemusíte to dělat.

Odeberte, označte vzorky a poté aplikujte ligandy a výživu. Inhibiční bude mít pomalejší rychlost růst ne smrt a použijte kontrolu s replikáty. Také pokud máte peníze, kupte si epac FRET pro měření cAMP. Najděte někoho, kdo bude dělat FRET, pokud nemůžete. Bude to trvat déle než jeden den, ale vyhneš se všemu Dal jsem tomu příliš mnoho, stejně to zemře. Pokud jste původně neoddělili své buněčné linie proteiny a máte v buněčných liniích směs Gs Gi a potřebujete zjistit, který ligand způsobuje dominantní odpověď, budete muset provést jednotlivce těchto testů. Existují společnosti, které se specializují na reakci růstu.

Pokud ne FRET. Najděte nějakou firmu pomocí ION torrentu a sekvenujte genom je opravdu velmi levná. Pokud vaše proteiny mají známou homologii s Gs nebo Gi, poskytne to nejrychlejší výsledky. Pokud je funkce proteinů nová, přidejte ligandy a Gi bude mít méně zesilovačů PCR než Gs. Nedělejte si vlastní extrakci NA, nechte je. Viděl jsem, že se tolik vzorků pokazilo při doručení, protože se lidé snažili ušetřit.

Vzhledem k tomu, že jste měli problém tento experiment navrhnout, najděte si společnost, která za vás celý experiment provede. Většina míst s ION torrenty má celé laboratorní nastavení pro spuštění takového experimentu a dělá to každý týden.


UPRAVENÁ ODPOVĚĎ

Na základě komentářů a odpovědí, které jsem obdržel, jsem se rozhodl odpověď upravit a odpovědět na některé otázky.

Vzhledem k tomu, že pracuji na proteinech, mám tendenci upřednostňovat přístupy založené na proteinech, zvláště když přemýšlím o přítomnosti proteinu. To je prostě ten případ, protože protein je to, co je důležité funkčně (zde mluvíme čistě o problémech/otázkách založených na proteinech a nemluvíme zde o věcech RNAi), takže to, co zkušení redaktoři požadují pro většinu článků, chtějí vidět nějaký druh proteinu práce. Nyní jsem si vědom, že to není vždy možné, protože protilátka (Ab) nemusí být příliš specifická nebo citlivá, speciálně pro proteiny s nízkou expresí. Pokud je protein vysoce přechodný, problém je ještě horší, což je důvod, proč se mnoho lidí uchyluje k expresi mRNA k deduktivnímu zdůvodnění přítomnosti proteinů, i když to vytváří řadu předpokladů o tom, jak je mRNA zpracována a zda vztah mezi mRNA exprese a hladina exprese proteinu je lineární, ale to je jiná diskuze. Takže vše, co se snažím říci, je, že je důležité zkontrolovat přítomnost proteinu pomocí technik založených na Ab, což jsou imunohistochemie (IHC) a western-blot (WB).

Takže mým primárním doporučením je používat druhově specifické (nezkříženě reaktivní) protilátky Gi a Gs ke kontrole přítomnosti vašich zájmových proteinů a vždy použít kontrolu těžkého řetězce Ab pro IHC a negativní kontrolu pro vaše WB pomocí vzorku, který know nevyjadřuje vaše zájmové proteiny, pokud je k dispozici. IHC vám také řekne nějaké prostorové informace a zda jsou G a Gi přítomny ve stejné buněčné linii nebo ne a zda se společně lokalizují atd. atd.! Samozřejmě zkontrolujte dostupnost Ab a zda je kompatibilní s postupy IHC nebo WB.

Další metoda, která je proveditelná, je, pokud víte, že vaše dvě různé buňky exprimují pouze jeden z G nebo Gi výlučně, můžete se podívat na jejich specifické inhibitory a přidat je k některým z vašich buněk a je pravděpodobné, že pokud je dávka dostatečně vysoká. způsobí smrt buněk, protože Gs nebo Gi jsou klíčové pro buněčnou funkci. Pravděpodobně vám projde podobný experiment s použitím jamek v 24jamkové misce, takže nebudete muset používat tolik médií nebo drog. Ale s věcmi, jako je tato, to nemusí fungovat a můžete získat mimocílové efekty, takže to udělejte jako doplňkový test. Pro váš test na drogy vždy proveďte kontrolu DMSO, protože je pravděpodobné, že to je to, v čem jsou léky rozpuštěny, a pokud ne, použijte jakékoli rozpouštědlo, ve kterém jsou léky rozpuštěny, a přidejte je do svých buněk ve svých kontrolních experimentech.

Nyní další možnou a běžně používanou metodou ke kontrole genové exprese proteinu a následnému odvození jeho přítomnosti jako proteinu je použití PCR založené na reverzní transkripci, jako je RT-PCR, i když nemusí probíhat v reálném čase. správně uvedeno v komentářích. Vezměte prosím na vědomí, že v tom nejsem vůbec odborník a zkontrolujte svou odpověď v této části, protože jsem osobně nedělal PCR založenou na reverzní transkripci. Pokud je mi známo, základním postupem je extrahování buněčné mRNA, což lze provést pomocí kitů jako RNeasy nebo podobného produktu (nepropaguji zde žádné produkty a právě na tyto jsem narazil!) . Protokoly jsou dodávány se soupravami a jsou k dispozici online a přesně vám řeknou, jaký minimální/maximální počet buněk/úroveň RNA by měl být přítomen a jak by měly být vaše buňky (peletovány) před zpracováním. Další metodou pro extrakci RNA je CsCl, ale to je dost chaotické a komplikované a vyžaduje vysokou odbornost, aby to bylo správně, ale vím, že je to pro určité situace nevyhnutelné, ale pro zpracování buněk postačí sada. Alespoň protokol RNeasy uvádí, že obohacuje mRNA a selektivně vylučuje jiné typy RNA. Jakmile budete mít svou buněčnou mRNA, můžete přistoupit k reverzní transkripci pomocí vhodně navržených primerů pro váš požadovaný gen pomocí termocykleru. Opět si nejsem jistý, jaké nástroje použít pro návrh primerů pro výrobu cDNA z mRNA a co hledat (kromě toho, že se ujistěte, že vaše primery jsou specifické), protože dělám pouze běžnou PCR, ale uvítám jakékoli úpravy! Jakmile se dostanete z mRNA na cDNA, můžete je spustit na svém agarózovém gelu (Ethidium bromid nebo cokoliv založeného na barvení DNA) a zjistit, zda je přítomen váš amplikon a zda má správnou velikost (opět na základě primerů, které jste si vybrali, budete vědět jaká je správná velikost) a tedy zda je váš gen exprimován nebo ne. Alespoň RNeasy kit říká, že nemusíte používat štěpení DNázou, abyste se zbavili jakékoli DNA před reverzní transkripcí vaší mRNA, protože většina z toho se při použití sady vyčistí, ale máte tuto možnost. Nyní ohledně sekvenování RNA nové generace o nich nic nevím, takže bych opět uvítal jakékoli úpravy, ale zdá se to zbytečné, protože chcete vědět, zda je vyjádřen požadovaný gen, takže nepotřebujete žádné informace o sekvenci, ale je to také možnost (i když si představuji trochu drahé?). Abychom zmínili něco velmi zřejmého, je důležité, aby druhy, ze kterých byly vaše linie vytvořeny, byly sekvenovány nebo abyste měli dobré sekvenční informace o genech Gs a Gi ve svých liniích, jinak by bylo navrhování primerů hádankou. Vždy je nejlepší zjistit, zda někdo udělal to, o co se snažíte, a požádat o jeho primery, protože většina lidí ráda sdílí činidla.

Pravděpodobně jste si zatím všimli, že mé metody jsou docela zaujaté směrem k přístupům molekulární biologie, a to jednoduše proto, že o tom vím více, nicméně skvělý návrh byl použít hladiny cAMP jako indikátor pro expresi Gs nebo Gi. Opět v tom nejsem odborník, protože jsem nikdy neanalyzoval malé molekuly, ale představuji si, že to zahrnuje něco jako HPLC, kterou musíte probrat s chemikem/biochemikem, jak extrahovat a vyčistit vaše buňky od všeho a nechat je. pouze cAMP. Pravděpodobně na to existuje postup/sada/biosenzor, ale nebudu se do toho pouštět, protože o tom prakticky nic nevím. U těchto typů nepřímých experimentů mám však varovnou poznámku. Nemám ponětí, jaké jsou vaše buněčné linie a jak dobře jsou charakterizovány, ale protože linie mají v sobě nejrůznější mutace a delece a inzerce, není dobrý nápad dělat závěry z hladin cAMP. Vzhledem k tomu, že přítomnost cAMP je pro buněčnou funkci docela důležitá, jejich absolutní hladiny v buněčné linii nejsou nutně dobrým indikátorem toho, zda je přítomen jeden regulátor produkce cAMP nebo ne, a jsem si jistý, že pokud uděláte něco takového, otevřete se hlavnímu kritiku ze strany kteréhokoli redaktora/referenta časopisu. V budoucích experimentech, které s těmito buňkami uděláte, bude dobrý nápad nadměrně exprimovat Gs nebo Gi a sledovat jejich účinky na produkci cAMP, ale prostě nedoporučuji používat hladiny cAMP jako jediný indikátor toho, zda Gs nebo Gi je vyjádřeno nebo ne.

Pokud všechno ostatní selže a vy jste unavení a chtěli byste si umýt ruce z tohoto identifikačního úkolu, můžete vždy své buňky lyzovat a poslat je na hmotnostní spektrometrii (MS), pokud takové zařízení ve vašem ústavu existuje. Je důležité, aby druhy, ze kterých vaše linie pocházejí, byly charakterizovány z hlediska jejich globálních proteinových sekvencí, protože programy jako Mascot dotazují nezpracovaná spektrální data proti databázím, jako je UniProt, aby získali pokrytí proteinů a následně proteinové zásahy. Než budete pokračovat v experimentech s MS, promluvte si se správcem zařízení a požádejte o radu, v jakém lyzačním pufru je nejlepší lyzovat vaše buňky a jaké složky by ve vašem lyzačním pufru neměly být a jak citlivé jsou jejich stroje a jak pravděpodobně dostanete detekci a jaká by měla být vaše koncentrace bílkovin. Myslím, že nejlepší stroj k použití je Orbitrap a obecně platí, že čím vyšší množství proteinu, tím větší pravděpodobnost, že ho odhalíte. Vzhledem k tomu, že buněčný lyzát je dost chaotický a kolony MS stroje se mohou nasytit hojnými proteiny, jako je aktin, bylo by nejlepší nechat lyzáty spustit na gelu SDS-PAGE za redukčních podmínek (můžete dokonce provést vícenásobné zatížení tím, že své vzorky spustíte v gel, vypnutí přístroje WB, načtení dalších vzorků a jejich vložení do gelu a pokračujte v tom několikrát. Funguje to, udělal jsem to sám, ale pro stažené vzorky, které jsou o něco čistší (méně kontaminantů/nežádoucích proteinů ) obecně). Jakmile váš gel projde skrz, stačí odříznout oblast gelu odpovídající molekulovým hmotnostem Gs a Gi a odeslat ji k identifikaci MS. Tato metoda (provedení vašeho lyzátu přes SDS-PAGE gel) se zbaví nežádoucích proteinů, které mohou narušovat proces identifikace. Ale MS je velmi drahá!

Opět velmi uvítám jakékoli úpravy mé vlastní upravené odpovědi! Jsem tu, abych pomáhal a učil se.


Estrogenová signalizace přes transmembránový G Protein–sdružený receptor GPR30

Steroidy hrají důležitou roli v regulaci normální fyziologie a léčbě onemocnění. Steroidní receptory byly klasicky popsány jako ligandem aktivované transkripční faktory zprostředkovávající dlouhodobé genomové účinky v hormonálně regulovaných tkáních. Nyní je jasné, že steroidy také zprostředkovávají rychlé signalizační události tradičně spojené s receptory růstových faktorů a receptory spřaženými s G proteinem. Ačkoli důkazy naznačují, že klasické steroidní receptory jsou schopny zprostředkovat mnoho z těchto událostí, novější objevy odhalují existenci transmembránových receptorů schopných reagovat na steroidy buněčnou aktivací. Jeden takový receptor, GPR30, je členem superrodiny receptorů spřažených s G proteinem a zprostředkovává aktivaci estrogen-dependentní kinázy a také transkripční reakce. V tomto přehledu poskytujeme přehled důkazů o buněčných a fyziologických účincích GPR30 v procesech závislých na estrogenu a diskutujeme o vztahu GPR30 s klasickými estrogenovými receptory.


Signalizace prostřednictvím receptoru spřaženého s G-proteinem Rickets je důležitá pro polaritu, oddělení a migraci hraničních buněk u Drosophila

Migrace buněk hraje klíčovou roli během vývoje. Vynikající model pro studium koordinovaných buněčných pohybů poskytuje migrace hraničních buněčných shluků ve vyvíjející se komoře vajíčka Drosophila. Ve screeningu mutageneze jsme izolovali dvě alely genové křivice (rk) kódující receptor spřažený s G-proteinem. Alely rk mají za následek defekty migrace hraničních buněk ve významné části vajíček. U mutantů rk jsou hraniční buňky správně specifikovány a exprimují marker Slbo. Přesto analýza fixních i živých vzorků odhalila, že některé jednotlivé hraniční buňky během migrace zaostávají za hlavním hraničním buněčným shlukem, nebo v jiných případech může celý hraniční buněčný shluk při migraci zůstat připoután k přednímu epitelu. Tyto defekty jsou pozorovány významně častěji v mozaikových hraničních buněčných shlucích než v plně mutantních shlucích. Redukce Rk ligandu, Bursicon, v hraničním buněčném shluku také vedla k migračním defektům, což silně naznačuje, že Rk signalizace je využívána pro komunikaci v samotném hraničním buněčném shluku. Shluky mutantních hraničních buněk vykazují defekty v lokalizaci adhezního proteinu E-cadherinu a proteinů apikální polarity během migrace. K chybné lokalizaci e-cadherinu dochází v mozaikových shlucích, ale ne v úplných mutantních shlucích, což dobře koreluje s fenotypem migrace buněk na hranici rk. Naše práce identifikovala receptor s dříve neznámou rolí v migraci hraničních buněk, který zřejmě reguluje oddělení a polaritu koordinačních procesů klastru hraničních buněk uvnitř buněk samotného klastru.

Klíčová slova: Adheze Border cells Migrace buněk Drosophila Polarity Rickets.

Copyright © 2016 Elsevier Inc. Všechna práva vyhrazena.

Postavy

Obrázek 1. Fenotyp migrace hraničních buněk…

Obrázek 1. Fenotyp migrace hraničních buněk rk mutanty exprimující Slbo marker

Obrázek 2. Živé zobrazování popisuje tethering…

Obrázek 2. Živé zobrazování popisuje fenotyp tetheringu rk mutanti

Obrázek 3 rk se vyjadřuje v…

Obrázek 3 rk je vyjádřena ve vaječníku a je vyžadována ve vnějším okraji…

Obrázek 4. Frézy jsou vyžadovány v…

Obrázek 4. V hraničních buňkách jsou vyžadovány frézy

( A ) Kvantifikace hranic…

Obrázek 5. Mozaikové hraniční shluky buněk vykazují…

Obrázek 5. Mozaikové hraniční shluky buněk vykazují zpoždění migrace a defekty oddělení

Obrázek 6. E-cadherin je chybně lokalizován v hranicích…

Obrázek 6. E-cadherin je chybně lokalizován v chybějících shlucích hraničních buněk rk

Obrázek 7. Nesprávná lokalizace markeru apikální polarity v…

Obrázek 7. Chybějící chybná lokalizace markeru apikální polarity v hraničních buněčných shlucích rk


Abstraktní

Receptory spřažené s G-proteinem krevních destiček ovlivňují funkci krevních destiček zprostředkováním odpovědi na různé agonisty, včetně ADP, tromboxanu A2a trombin. Blokáda receptoru ADP, P2Y12v kombinaci s inhibicí cyklooxygenázy-1 aspirinem patří mezi nejpoužívanější farmakologické strategie ke snížení výskytu kardiovaskulárních příhod u vysoce rizikových pacientů. Posledně jmenovaná strategie blokády dvou cest je jedním z největších pokroků na poli kardiovaskulární medicíny. Kromě P2Y12Receptor trombinu krevních destiček, proteázou aktivovaný receptor-1, byl také nedávno zaměřen na inhibici. Blokáda proteázou aktivovaného receptoru-1 byla spojena se sníženým výskytem trombotických příhod, když byla přidána ke strategii využívající P2Y12 a inhibice cyklooxygenázy-1. V současné době zůstává relativní příspěvek těchto signálních drah receptorů spřažených s G-proteinem k trombóze in vivo neúplně definován. Pozorování selhání léčby u ≈10 % vysoce rizikových pacientů léčených aspirinem a silným P2Y12 inhibitory poskytují důvod pro zacílení nových drah zprostředkovávajících funkci krevních destiček. Zacílení intracelulární signalizace downstream od receptorů spřažených s G-proteinem pomocí fosfotidylionisitol 3-kinázy a inhibitorů Gq patří mezi nové strategie, které jsou předmětem výzkumu, aby se zabránilo výskytu arteriální ischemické příhody. Větší pochopení mechanismů signalizace zprostředkované receptorem spřaženým s G-proteinem může umožnit přizpůsobení protidestičkové terapie.

Úvod

Rychlá aktivace a agregace krevních destiček jsou klíčové pro rozvoj arteriálních trombotických příhod. Krevní destičky adherují k místu poraněné cévní stěny po spontánní ruptuře plátu během akutního koronárního syndromu (AKS) a během perkutánní koronární intervence (PCI). Přilepené krevní destičky podléhají změně tvaru, cytosolické mobilizaci Ca++ a aktivaci. Aktivace krevních destiček vede k uvolnění sekundárních agonistů, tromboxanu A2 a adenosindifosfát (ADP). Tito agonisté zesilují odpověď na poranění a produkují trvalou agregaci krevních destiček v přítomnosti vysokých tepenných střihových rychlostí. Současně se po expozici krve buňkám nesoucím tkáňový faktor v subendoteliálním kompartmentu vytvářejí subpikomolární koncentrace trombinu a aktivují krevní destičky štěpením receptorů aktivovaných proteázou destiček (PAR). Aktivace krevních destiček zase vede k tvorbě většího množství trombinu na prokoagulačním povrchu krevních destiček a na uvolněných mikročásticích. Trombin přeměňuje fibrinogen na fibrin, aby dále stabilizoval krevní destičku-fibrinovou sraženinu. 1 V současné době existuje hlavní polemika o relativním příspěvku každé dráhy aktivace destiček vyvolané agonistou (ADP, tromboxan A2a trombin) ke vzniku in vivo stabilního trombu. Posledně uvedené určení je kritické při rozhodování o zacílení léků.

Všechny články publikované v této sérii najdete na http://atvb.ahajournals.org/site/misc/ATVB_in_Focus.xhtml.

Analýza lidského genomu prokázala ≈ 1000 jedinečných receptorů spojených s G-proteinem (GPCR) spojených s širokou řadou fyziologických funkcí. 2 GPCR regulují mnoho buněčných dějů u lidí prostřednictvím signální transdukce stimulované různými agonisty. GPCR jsou cílem ≈30 % až 50 % všech komerčně dostupných léků. 3 Funkce krevních destiček je ovlivněna rozpustnými agonisty, kteří stimulují intracelulární signalizaci prostřednictvím GPCRs ADP až P2Y1 a P2Y12, trombin prostřednictvím PAR-1 a PAR-4, tromboxan A2 prostřednictvím TP, epinefrinu prostřednictvím α-adrenergního receptoru a prostaglandinu (PG)I2 přes IP. 4,5 Tyto signální dráhy jsou vysoce konzervované stejně jako regulační mechanismy.

GPCR se skládají z jediného polypeptidového řetězce se 7 transmembránovými a-helixy spojenými třemi extracelulárními smyčkami a 3 intracelulárními smyčkami. Extracelulární smyčka se skládá z amino-konce a vazebného místa ligandu (agonisty), intracelulární smyčka se skládá z karboxy-terminální domény spojené s guaninnukleotidovými vazebnými proteiny (G proteiny Obrázek 1). Jediný GPCR může být spojen s více funkčně odlišnými G proteiny, které vyvolávají specifické intracelulární reakce na agonisty.G proteiny jsou heterotrimery s α, β a γ podjednotkami. Gα podjednotka ve svém inaktivovaném stavu je vázána na guanosindifosfát (GDP) a těsně spojena s βγ podjednotkou. Při aktivaci agonisty je GDP nahrazen GTP, čímž se uvolňují jednotky α a βγ pro interakce s downstream efektory. V závislosti na typu receptoru je podjednotka α asociována s fosfolipázou C-β (PLC-β), Rho-GEF (guanin nukleotidový výměnný faktor) nebo aktivitou adenylylcyklázy, zatímco βγ podjednotka je asociována s fosfotidylionisitol 3-kinázou (PI3K ) a aktivita PLC-β. Poměrně méně je známo o funkci podjednotky βγ. 4,5

Obrázek 1. Signalizace receptoru spřaženého s G-proteinem (GPCR) v krevních destičkách. Vazba agonisty na extracelulární smyčce GPCR je spojena s výměnou GTP za GDP na podjednotce a, což vede k disociaci podjednotky a od podjednotky βγ. V závislosti na typu receptoru podjednotka α aktivuje fosfolipázu C-β (PLC-β), Rho-GEF (guanin nukleotidový výměnný faktor) nebo adenylylcyklázu, zatímco podjednotka βγ aktivuje fosfotidylionisitol 3-kinázu (PI3K) a PLC-β . Receptor aktivovaný proteázou (PAR) je aktivován trombinem vytvořením uvázaného ligandu nebo prostřednictvím nekanonického mechanismu, kdy ke štěpení proteinázou dochází v místě odlišném od kanonického místa štěpení. Uvázaný ligand může také stimulovat signalizaci prostřednictvím dráhy nezávislé na G-proteinu, která zahrnuje signální lešení zprostředkované β-arestiny. β-arestin se také podílí na internalizaci a desenzibilizaci PAR receptorů.

Existuje ≥10 forem Gα v krevních destičkách, které jsou členy rodin Giα, Gqα, G12/13α a Gsα. G proteiny jsou spojeny s redundancí ve svých odpovědích (signální dráhy). Proto je zacílení na receptor >gt1 atraktivní protidestičkovou strategií. Přímá inhibice krevních destiček specifických GPCR (P2Y12 nebo PAR-1) a enzymy spojené s uvolňováním agonisty krevních destiček (COX-1) byly široce využívány ve srovnání s přímou inhibicí G proteinů nebo downstream signálních drah. 6 Na rozdíl od 2stavového modelu aktivace receptoru (neaktivní versus jedna aktivní konformace) bylo navrženo, že GPCR existují ve více ligandově specifických aktivních konformacích, které jsou spojeny s různými downstream signalizačními událostmi. Schopnost agonisty vyvolat odezvu ze specifického GPCR, která se mění napříč signálními drahami, se nazývá zkreslený agonismus. Vychýlení agonisté GPCR mají terapeutický potenciál díky své schopnosti indukovat rozdílnou signalizaci spojenou s žádoucími účinky. 7–10

Krátkodobá desenzibilizace GPCR nastává prostřednictvím fosforylace kinázami, které zvyšují afinitu k adaptorovým proteinům známým jako β-arestiny. Následně dochází k rozpojení interakce mezi GPCR a G proteinem, což vede k endocytóze prostřednictvím jamek potažených klatrinem. Interakce GPCR–β-arestin jako multifunkční lešení a adaptér také aktivuje signální dráhy. Role arestinů v regulaci funkce krevních destiček je věnována zvýšená pozornost (viz níže). 8–10 Ačkoli bylo v posledním desetiletí získáno velké množství informací o signalizaci a regulaci indukované GPCR, funkce specifických GPCR u aterotrombózy zůstává neúplně definována.

Purinergní receptory

ADP je uložen v destičkách hustých granulích a je uvolňován aktivací agonisty a vysokým arteriálním střihem. ADP působí na 2 GPCR: P2Y1 a P2Y12. Třetí destičkový purinergní receptor, P2X1, je non-GPCR ligandem ovládaný iontový kanál. Aktivace P2X1 ATP je spojeno s rychlým přílivem vnějšího Ca++ a změnou tvaru krevních destiček.

P2Y1 je polypeptid o 373 aminokyselinách spojený s proteinem Gq. Je široce distribuován v lidských tkáních. Přibližně 150 P2Y1 receptory jsou přítomny na destičce. α podjednotka Gq je spojena s aktivitou PLC-β. Aktivace PLC-β vede k hydrolýze fosfoinositidu a cytosolické mobilizaci Ca++ prostřednictvím generovaného IP. Poslední signální událost má za následek změnu tvaru, sekreci granulí a PLA2 a aktivaci integrinu. Fosfolipáza A2 aktivace vede k produkci kyseliny arachidonové z membránových fosfolipidů a následné syntéze a uvolňování tromboxanu A2 COX-1 a aktivitou tromboxansyntázy (obrázek 2). 11

Obrázek 2 Přehled signálních drah hlavních receptorů spřažených s G-proteinem. Adenosindifosfát aktivuje krevní destičky prostřednictvím P2Y1 a P2Y12 receptory. P2Y1 je spojen s Gq, který aktivuje fosfolipázu (PLC)-β prostřednictvím Gqα a jeho intracelulární signalizace vede ke změně tvaru destiček, sekreci granulí a zesílení aktivace destiček prostřednictvím tvorby tromboxanu A2. P2Y12 je spojen s Gi. Podjednotka a Gi je spojena s aktivitou fosfoprotein fosforylázy stimulovanou adenylylcyklázou a vazodilatátorem. Podjednotka βγ je spojena s PI3-kinázou, která aktivuje kinázy rodiny Akt, Rap1, ERK a Src a vnitřně usměrňující draslíkové kanály s G-proteinem (GIRK), kromě aktivity PLC-β, jak je popsáno výše. Aktivace P2Y12 vede k aktivaci glykoproteinu (GP) IIb/IIIa a stabilní agregaci krevních destiček. Epinefrin je spojen s proteinem Gz, který při aktivaci inhibuje aktivitu adenylylcyklázy prostřednictvím podjednotky α. Prostaglandin I2 (CHZO2) receptor je spojen s proteinem Gs, který při aktivaci stimuluje aktivitu adenylylcyklázy prostřednictvím podjednotky α. DAG označuje diacylglycerol ERK, extracelulárním signálem regulovanou kinázu IP3, inositol 1,4,5-trifosfát MLCK, kinázu lehkého řetězce myosinu PLA2, fosfolipázu A2 Pls, fosfolipidy Tx A2tromboxan A2 a VASP, vasodilatátorem stimulovaný fosfoprotein.

Signalizace po proudu z obou P2Y1 a P2Y12 je zodpovědný za normální agregaci krevních destiček. P2Y1 signalizace je zodpovědná za počáteční aktivaci krevních destiček, změnu tvaru a přechodnou agregaci krevních destiček, zatímco P2Y12 signalizace účinněji zesiluje agregaci krevních destiček indukovanou ADP a jinými agonisty. Mezi výzvy pro P2Y1 Inhibitory receptoru jako antitrombotické látky je jejich rozšířená exprese v lidských tkáních. Ve zvířecím modelu používajícím laserem indukované poškození byla mezenterická arteriální trombóza inhibována P2Y1 antagonista (MRS2500) a krvácení bylo středně ovlivněno. 12 V současné době P2Y1 antagonisté, jako je A3P5PS, MRS2500 a MRS2179, nebyly studovány v lidských studiích.

P2Y12

P2Y12 Receptor obsahuje 342 aminokyselin a je exprimován hlavně v krevních destičkách a v menší míře v centrálním nervovém systému. 13 Přibližně 600 P2Y12 receptory jsou přítomny na destičce. Ve srovnání s P2Y1exprese P2Y omezeného typu buněk12 z něj činí ideální antitrombotický cíl. Inhibice agregace krevních destiček P2Y12 blokátory lze překonat stimulací Gzα signalizace epinefrinem. 14 P2Y12 receptor má ≈24% sekvenční homologii s receptorem PAR-1. Nejnověji rentgenová strukturální analýza lidského P2Y12 odhaluje neobvyklou přímou konformaci transmembránové helixu V, která se liší od jiných GPCR třídy A, s dlouhou a-helikální extenzí do cytoplazmy, kde může tvořit rozsáhlé interakce s G proteinem. 15,16 Ačkoli je toto pozorování spekulativní, může vysvětlit, proč P2Y12 tvoří přednostně vysokoafinitní interakce s Gai na úkor jiných Gai vazebných členů, jako je PAR-1. 17 Na základě modelu termostabilizační konstrukce jsme uvedli, že byly přítomny disulfidové vazby přemosťující amino-konec Cys17 s Cys270 šroubovice VII a vysoce konzervovaná disulfidová vazba přemosťující Cys97 šroubovice III a Cys175 extracelulární smyčky 2. Během vazby agonisty s 2MesADP tvoří karbonyl hlavního řetězce Cys97 vodíkovou vazbu s 3′ hydroxylovou skupinou ribózy 2MesADP. Aminoskupina hlavního řetězce Cys175 interaguje s β-fosfátovou skupinou. Vazba s antagonistou, AZD1283, byla spojena s narušením disulfidové vazby Cys97–Cys175. Poslední disulfidová vazba se však zdá být dynamická. Předpokládá se také, že aktivní thiolaktonové metabolity thienopyridinů destabilizují interakce P2Y12 receptor s nukleotidovými agonisty, jako je ADP, tím, že se kovalentně naváže na volný thiol Cys97 a tím ireverzibilně zabrání signalizaci ADP. Deriváty ATP, jako je 2MesATP, ARC66096 (neštěpitelné trifosfátové mimetikum), cangrelor (ARC69931MX) a ARC67085, se také váží na P2Y12 receptoru podobným způsobem jako 2MesADP a zabraňují vazbě ADP. Kvůli objemnému N6 substituentu se ticagrelor (AZD6140) nemůže vázat na P2Y12 receptor v konformaci podobné 2MesADP. Kromě toho se nenukleotidové deriváty, jako je AZD1283 a tikagrelor, chovají jako kompetitivní antagonisté. Bylo také hlášeno, že zbytek R256, který potenciálně přichází do kontaktu s 2MesADP, je důležitý pro P2Y12 aktivace, zatímco zbytek R265 v extracelulární smyčce 3 je také důležitý pro agonistickou aktivitu, ale neinteraguje přímo s 2MesADP. 15,16

Podjednotka Gi2a spojená s P2Y12 je spojena se supresí aktivity adenylylcyklázy. Inhibice cAMP-dependentní proteinkinázy zprostředkované fosforylace vazodilatátorem stimulovaného fosfoproteinu je spojena s aktivací glykoproteinu IIb/IIIa. 14 Jako marker P2Y12 receptorová signalizace, vasodilatační stimulovaná fosforylace fosfoproteinu se používá k monitorování protidestičkové odpovědi na P2Y12 blokátory receptorů.

Redukce cAMP pomocí Gia-asociované inhibice aktivity adenylyl cyklázy samotná není dostatečná pro normální agregaci downstream signalizace prostřednictvím aktivity βγ podjednotky hraje hlavní roli. Podjednotka βγ je spojena s aktivací PLC-β vedoucí k mobilizaci Ca++, změně tvaru a sekreci granulí prostřednictvím uvolňování diacylglycerolu a IP3 z PIP2. Podjednotky βγ jsou také spojeny s aktivitou PI3K, která je spojena s aktivací glykoproteinu IIb/IIIa prostřednictvím katalytické modulace aktivit Akt a Rap1b. Bylo hlášeno, že aktivace Rap1b je důležitá pro trvalou aktivaci GPIIb/IIIa. Aktivace Akt vyvolaná PAR-1 závisí převážně na stimulaci Gi prostřednictvím sekretovaného ADP. Kromě toho Gi signalizace také vede k aktivaci kinázy regulované extracelulárním signálem, kinázy lehkého řetězce myosinu, kináz rodiny Src a vnitřně usměrňujících draslíkových kanálů s G-proteinem 14,18 (obrázek 2).

P2Y12 aktivace je také spojena s expozicí fosfatidylserinu a prokoagulačními vlastnostmi. 19,20 Bylo prokázáno, že klopidogrel a aktivní metabolit prasugrelu zeslabují prokoagulační aktivitu. 21,22 Navíc P2Y12 aktivace receptoru také ovlivňuje tvorbu kolagenem a trombinem aktivovaných krevních destiček, které exprimují prokoagulační faktory, jako je fosfatidylserin a aktivovaný faktor V. 23 Kromě toho P2Y12 aktivace je spojena s expresí P-selektinu a CD-40 L, které ovlivňují interakce krevních destiček a leukocytů a modulují zánět a expozici tkáňovým faktorům. 1 V tuto chvíli P2Y12 intracelulární signální dráhy zůstávají neúplně definovány.

P2Y12 Inhibice

Hlavním cílem P2Y12 Inhibiční terapie je rychlé ustavení blokády receptorů na vysoké úrovni, aby se zabránilo amplifikaci aktivace krevních destiček indukované ADP a jinými agonisty, které degranulují krevní destičky. Reverzibilita P2Y12 inhibitor může být přínosem pro snížení krvácení. P2Y12 inhibitory jsou po aspirinu nejčastěji předepisovanými protidestičkovými látkami v kardiovaskulární medicíně.

Thienopyridiny

Tiklopidin, klopidogrel a prasugrel jsou klinicky dostupná perorálně podávaná thienopyridinová proléčiva, která jsou metabolicky aktivovaná cestou cytochromu P450. Farmakodynamické studie přesvědčivě prokázaly širokou variabilitu odpovědi a nereaktivitu na klopidogrel. Mechanismy rezistence na klopidogrel byly v posledních 10 letech intenzivně zkoumány. Suboptimální tvorba aktivních metabolitů a farmakodynamické účinky souvisejí s jednonukleotidovými polymorfismy v genech kódujících specifické cytochromy CYP P450 spojenými se ztrátou funkce, interakcí lék-lék mezi thienopyridiny a jinými současně podávanými léky, které konkurují/inhibují specifické cytochromy CYPP450 a demografickými proměnnými. Protože P2Y12 inhibitory se podávají společně s různými farmakologickými činidly, důležité je také zamezení farmakologických interakcí. 24

Vývoj prasugrelu byl pokrokem v terapii thienopyridinem. Prasugrel je rychleji a účinněji metabolizován než klopidogrel, a je tedy spojen s rychlejším nástupem účinku a větší inhibicí ADP-indukované agregace krevních destiček, což má za následek menší variabilitu odpovědi a nižší prevalenci nereagování než klopidogrel. 25 Aktivní metabolity prasugrelu a klopidogrelu mají in vitro podobný P2Y12 vazebné afinity a výsledné protidestičkové účinky. Zvýšený protidestičkový účinek prasugrelu je tedy způsoben zvýšenou tvorbou a expozicí aktivního metabolitu prasugrelu ve srovnání s klopidogrelem. 26

Ticagrelor

Ticagrelor, nedávno schválený cyklopentyltriazolopyrimidin, je reverzibilně vázající, selektivní, silný, přímo působící a perorálně podávaný P2Y12 blokátor receptorů. 27 Ticagrelor nebrání vazbě ADP na P2Y12, ale místo toho reverzibilně inhibuje ADP-indukovanou receptorovou konformační změnu a aktivaci G-proteinu vazbou na místo odlišné od ADP-vazebného místa. Tyto vlastnosti udržují receptor v neaktivním stavu a po uvolnění tikagreloru může být receptor reaktivován ADP. Na základě modelových dat jsme navrhli, že kvůli svým objemným 7-[2-(3,4-difluorfenyl)-cyklopropylamino] a 5-propylsulfanylovým substituentům se ticagrelor nemůže umístit do středu transmembránové klece (v stejná kapsa), kde se ADP váže, ale spíše se váže na druhou kapsu sestávající z horních transmembránových domén (domény 1, 2 a 7), extracelulární smyčky 2 a N-terminální domény P2Y12 (viz výše). 28

Ticagrelor je rychle metabolizován jaterním CYP3A4/5 za vzniku AR-C124910XX, hlavního metabolitu tikagreloru, který je ekvipotentní při inhibici P2Y12 receptor. Ticagrelor je ve srovnání s klopidogrelem spojen s rychlým nástupem účinku, vyšší úrovní inhibice a rychlejším odezněním farmakodynamického účinku. 27

Ticagrelor a inhibice vychytávání adenosinu

Protidestičkový efekt

Kromě P2Y12 inhibici, tikagrelor inhibuje zpětné vychytávání adenosinu v erytrocytech a dalších buňkách. 29–32 Posledně uvedený účinek byl připisován inhibici na sodíku nezávislého ekvilibračního nukleosidového transportéru. Na rozdíl od silného inhibitoru zpětného vychytávání adenosinu, dipyridamolu, tikagrelor vykazoval 16krát nižší afinitu k ekvilibračnímu nukleosidovému transportéru 1 (Ki=41 oproti 2,6 nmol/l). Jiné blokátory P2Y12, jako jsou aktivní metabolity klopidogrelu a prasugrelu, kangrelor a AR-C124910xx, však nemají významný vliv na zpětné vychytávání adenosinu. Ticagrelor má ≈20krát vyšší afinitu k P2Y12 ve srovnání s afinitou ekvilibračního nukleosidového transportéru 1. Nebyl zjištěn žádný přímý vliv tikagreloru na adenosinové receptory a tikagrelor není metabolizován na adenosin. 29 Ve studii in vitro byl v přítomnosti adenosinu protidestičkový účinek tikagreloru částečně zprostředkován lékem indukovaným zvýšením extracelulárních hladin adenosinu a adenosinem zprostředkovanou inhibicí krevních destiček prostřednictvím receptoru A2A. 30 Byla hlášena signifikantně vyšší plazmatická koncentrace adenosinu v krvi odebrané pacientům s AKS léčeným tikagrelorem než klopidogrelem. Kromě toho bylo in vitro vychytávání exogenního adenosinu erytrocyty inhibováno při inkubaci se sérem pacientů léčených tikagrelorem, ale ne klopidogrelem. 31

Koronární průtok krve a účinek velikosti infarktu

Ve zvířecím modelu tikagrelor a dipyridamol v závislosti na dávce zvýšily průtok krve levou přední sestupnou koronární arterií po okluzi a po intrakoronárním podání adenosinu. 32 Ve studii se zdravými dobrovolníky tikagrelor zvyšoval rychlost koronárního průtoku krve, která korelovala s hladinami tikagreloru v plazmě. Hladiny AR-C124910xx však nekorelovaly se zvýšeným průtokem krve, což naznačuje, že účinky krevního toku související s adenosinem byly omezeny na tikagrelor. 33 V následné prospektivní zkřížené studii 56 pacientů s AKS bez elevace ST segmentu, kteří podstoupili PCI, byl tikagrelor, ale nikoli prasugrel, spojen s vyšší rychlostí koronárního průtoku krve, když byly souběžně podávány zvyšující se dávky adenosinu. 34 Bylo prokázáno, že tikagrelor, ale ne klopidogrel, snižuje velikost infarktu u potkaního perfuzního modelu, který byl zcela zvrácen antagonistou adenosinového receptoru, což naznačuje, že druhý účinek je zprostředkován endogenním adenosinem. 35 Podobně v modelu koronární trombózy u psů tikagrelor, ale nikoli klopidogrel, významně snížil velikost infarktu a rychle obnovil perfuzi tkání, když se přidal k aktivátoru plasminogenu tkáňového typu. 36 Tyto mimocílové účinky tikagreloru mohou být zodpovědné za některé klinické přínosy spojené s tikagrelorem než s léčbou klopidogrelem pozorované ve studii Platelet Inhibition and Patient Outcomes (PLATO).

Interakce mezi tikagrelorem a aspirinem

Ve studii PLATO byla v severoamerické podskupině ve srovnání se zbytkem světa pozorována nepřítomnost příznivého účinku tikagreloru oproti klopidogrelu při léčbě AKS. Druhý paradox byl připisován vyšší souběžné dávce aspirinu užívané v Severní Americe, ale nesouhlasné výsledky může vysvětlit i hra náhody. 37 Je třeba poznamenat, že nebyl hlášen žádný vliv dávky aspirinu na klinickou účinnost prasugrelu ani klopidogrelu, P2Y12 inhibitory, které produkují méně účinný P2Y12 blokáda než tikagrelor. 38,39

Ukázalo se, že ADP-P2Y12 Pro tvorbu tromboxanu A je důležitá signální dráha2 a pro ireverzibilní agregaci spojenou s aktivací TP receptoru. 40,41 V přítomnosti vysoké koncentrace tikagreloru in vitro nevykazoval aspirin další antiagregační účinky v reakci na ADP, kyselinu arachidonovou, U46619 (agonista TP receptoru), epinefrin a peptid aktivátoru trombinového receptoru. 42 V ex vivo studii účinku dávky aspirinu na funkci krevních destiček byly vyšší dávky aspirinu 81 mg denně spojeny s větším protidestičkovým účinkem. 43 Bylo prokázáno, že P2Y12 inhibitory snižují tromboxan A2– indukovaná agregace krevních destiček a tromboxan A2 produkci a senzibilizaci krevních destiček k antiagregačním účinkům CHZO2 zablokováním P2Y12 receptorem zprostředkovaná inhibice adenylylcyklázy. S tímto pozadím bylo navrženo, že vysoké dávky aspirinu v přítomnosti silného P2Y12 blokáda vyvolaná tikagrelorem může snížit produkci CHZO2 a posun vlivu aspirinu směrem k protrombotickému prostředí. Kromě toho inhibicí produkce gastroprotektivních prostanoidů se může také zvýšit riziko gastrointestinálního krvácení. 44 Bylo také hlášeno, že vysoká dávka, ale nikoli nízká dávka aspirinu, je spojena se zhoršeným antikontraktilním účinkem tikagreloru na kontrakci buněk hladkého svalstva cév indukované ADP na potkaním modelu. 45

Cangrelor

Omezení spojené se všemi aktuálně dostupnými ústními P2Y12 inhibitory je nedostatek okamžitého a reverzibilního farmakodynamického účinku. I když se tikagrelor váže reverzibilně, jeho farmakodynamický offset je pomalý. 38 Protože okamžité P2Y12 inhibice je hlavním cílem v léčbě vysoce rizikového onemocnění koronárních tepen, atraktivním přístupem je parenterální terapie (část Inhibice interakce PAR-1 a G proteinu v tomto článku). Navíc je také žádoucí rychlý farmakodynamický offset při krvácení. Konečně u pacientů s chronickou P2Y12 blokáda, kteří potřebují operaci po stentování koronární tepny, podání přemosťujícího P2Y12 inhibitor s rychlým offsetovým účinkem může omezit náchylnost k trombóze v perioperačním období.

Cangrelor (dříve známý jako AR-C67085MX) je přímo působící parenterální analogová modifikace ATP polyfosfátového postranního řetězce ATP, která zabraňuje rozpadu na ADP a substituce adeninové skupiny zvyšuje P2Y12 receptorová afinita a selektivita. Funkce krevních destiček indukovaná ADP je kompetitivně inhibována kangrelorem s rychlým nástupem a offsetem během několika minut. 46 V preklinických studiích byla tvorba trombu inhibována infuzí cangreloru. 47 Cangrelor byl studován ve studiích CHAMPION (Cangrelor versus Standard Therapy to Achieve Optimal Management of Platelet Inhibition) pro akutní terapii u pacientů podstupujících PCI a také jako přemosťovací strategie u pacientů dříve léčených klopidogrelem, kteří vyžadují urgentní chirurgický zákrok. 48–50 Cangrelor ještě není klinicky schválen.

Farmakodynamické interakce mezi P2Y12 Blokátory

Po současném podání kangreloru a klopidogrelu nebyly pozorovány očekávané úrovně inhibice krevních destiček indukované klopidogrelem, což ukazuje na lékovou interakci. Na základě těchto pozorování jsme navrhli, že kangrelor zabraňuje tvorbě thiolových aduktů aktivními metabolity klopidogrelu a prasugrelu v extracelulární oblasti P2Y12. 51 Dále bylo prokázáno, že preinkubace krve s kangrelorem před přidáním klopidogrelu nebo aktivního metabolitu prasugrelu snížila schopnost metabolitu ireverzibilně antagonizovat P2Y12. Ireverzibilní inhibice však byla zachována, když byla krev preinkubována s metabolity před přidáním kangreloru. 52 Ve studii na zvířatech ex vivo a ve studii pacientů se stabilním onemocněním koronárních tepen nebyla prokázána významná farmakodynamická interakce mezi tikagrelorem a kangrelorem. 53,54 Interakce mezi kangrelorem a thienopyridiny může mít důležité klinické důsledky, když je naložen klopidogrel nebo prasugrel a kangrelor se váže na P2Y12.

Přechod z chronické terapie klopidogrelem po příhodě AKS na udržovací dávku prasugrelu nebo nasycovací dávku byl spojen s dalším snížením funkce krevních destiček. 55 Přechod na léčbu prasugrelem 12 hodin po poslední dávce udržovací léčby tikagrelorem byl však spojen se zvýšením reaktivity krevních destiček ve srovnání s pokračující léčbou tikagrelorem. 39 Vzhledem k tomu, že aktivní metabolity thienopyridinu jsou exponovány pouze přechodně, k farmakodynamickým interakcím dojde pravděpodobněji po přechodu na léčbu než u tikagreloru, přímo působící látky s delším plazmatickým poločasem. Interakce tikagrelor–prasugrel byla částečně zmírněna podáním nasycovací dávky prasugrelu. Čekání déle než 12 hodin na další P2Y12 Aby se receptory nevázaly tikagrelorem před zatížením prasugrelem nebo opakovaným zatížením prasugrelem, může dále zmírnit farmakodynamický účinek. Relativní příspěvek aktivního metabolitu tikagreloru (AR-C124910XX) k interakci není znám. 39 Je zapotřebí další práce k definování vazebných míst různých P2Y12 inhibitory a dávkovací režimy, které optimálně zeslabují farmakodynamické interakce během změny.

Další novinka P2Y12 Antagonisté receptorů

AZD1283

Nová řada ethyl 6-aminonikotinát acyl sulfonamidů byla nedávno objevena jako P2Y12 antagonisté. Výzkumy vztahu mezi strukturou a aktivitou prokázaly, že nahrazení 5-chlorthienylu ethyl-6-aminonikotinátacylsulfonamidu benzylovým substituentem je spojeno se zvýšeným antiagregačním účinkem, zatímco zavedení substituentů na benzylové skupině vedlo k vyšší mikrosomální clearance, ale žádné další zvýšení antiagregační potence. Mezi 6 sloučeninami byla 1 kandidátní sloučenina, AZD1283, spojena s nejsilnější inhibicí ADP-indukované agregace krevních destiček, zvýšeným průtokem krve a terapeutickým indexem ≥10 v oddělení účinnosti a doby krvácení. AZD1283 byl vybrán pro další klinické studie. Jeho vazebné vlastnosti s P2Y12 jsou diskutovány výše. 56

Diadenosin 5′,5″-P1,P4-dithio-P2,P3-chlormethylentetrafosfát (Ap4A)

Diadenosin 5′,5″-P1,P4-dithio-P2,P3-chlormethylentetra-fosfát je členem dinukleosidových polyfosfátů, které jsou uloženy v destičkách hustých granulích a uvolňují se při aktivaci spolu s ADP a ATP. Bylo publikováno, že Ap4A se stereo konfigurací na P1 a P4 má silnou plazmatickou stabilitu a inhibiční účinek na P2Y12 a menší vliv na P2Y1. Tato sloučenina zůstává předmětem vyšetřování. 57

Silný P2Y12 blokátory receptorů, prasugrel a tikagrelor, jsou u pacientů s AKS spojeny s nižším výskytem ischemických příhod ve srovnání s klopidogrelem. Stále však existuje klinická neuspokojená potřeba. Stupeň snížení nežádoucích účinků (≈20 % relativní a ≈2 % absolutní) ve srovnání s léčbou klopidogrelem je mírný a selhání léčby (≈10 %) přetrvává spolu s významně vyšším rizikem krvácení. Poslední pozorování naznačují, že strategie COX-1 a silný P2Y12 inhibice je spojena se stropem čistého klinického přínosu. Inhibice další aktivace krevních destiček zprostředkující GPCR, jmenovitě PAR-1, byla zkoumána jako nová strategie pro snížení selhání léčby spojené s konvenční duální protidestičkovou terapií. 58

PAR hrají důležitou roli v normálních a patologických stavech a byly zaměřeny na terapii různých onemocnění, včetně kolitidy, astmatu a nádorových metastáz, kromě kardiovaskulárních onemocnění. PAR-1, hlavní receptor pro trombin, obsahuje 425 aminokyselin a je to vysoce afinitní receptor s rychlou a přechodnou downstream signalizací. Na jedné destičce je přítomno přibližně 1000 až 2000 receptorů PAR-1. Kromě krevních destiček je receptor PAR-1 exprimován také v jiných buňkách a hraje roli v modulaci zánětu a v procesech vaskulární remodelace v nestabilních aterosklerotických plátech a při restenóze. 17,59 Inhibice PAR-1 proto může přinést klinické výhody nad rámec modulace funkce destiček.

PAR jsou aktivovány prostřednictvím nového mechanismu připoutaného ligandu. Sekvence podobná hirudinu N-terminální exodomény PAR-1 se váže s vysokou afinitou na exosite-1 trombinu (místo vázající fibrinogen), což mu umožňuje překonat fibrinogen (přítomný ve velkých množstvích v krvi) o vazbu trombinu. 58,60 Trombin štěpí vazbu mezi Arg 41 a Ser 42 PAR-1 v extracelulární doméně, čímž obnažuje nový N konec s počáteční sekvencí SFLLRN (serin–fenylalanin–leucin–leucin–arginin–asparagin). Jakmile je tento navázaný ligand odštěpen, rychle podléhá konformační změně a váže se na vazebné místo pro ligand-I umístěné v N-terminální exodoméně. To vede ke konformační změně v transmembránových doménách, která se přenáší do intracelulárních domén a nakonec stimuluje výměnu GDP-GTP a aktivuje G12/13a Gq (obrázek 3).

Obrázek 3 P2Y12, proteázou aktivovaný receptor (PAR)-1 a PAR-4 signální dráhy v krevních destičkách. Trombin se váže na hirudinu podobnou sekvenci N-terminální exodomény PAR-1 a štěpí extracelulární doménu, čímž exponuje uvázaný ligand se sekvencí SFLLRN. Uvázaný ligand rychle podléhá konformační změně a váže se na vazebné místo I ligandu umístěné v N-terminální exodoméně receptoru. Následná konformační změna v receptoru PAR-1 vede k aktivaci G12/13 a Gq, což nakonec vede ke změně tvaru, sekreci granulí a přechodné agregaci krevních destiček prostřednictvím aktivit Rho-GEF (guanin nukleotidový výměnný faktor) a fosfolipázy C-p (PLC-p), v daném pořadí. Trombin se váže k aktivnímu místu PAR-4 prostřednictvím nízkoafinitního, negativně nabitého shluku aminokyselinových zbytků a štěpí extracelulární doménu, čímž exponuje tetherovaný ligand se sekvencí GYPGOV. Podobně jako u PAR-1 vede aktivace PAR-4 prostřednictvím uvázaného ligandu k aktivaci Rho-GEF a PLC-β, která nakonec vede k prodloužené a nevratné agregaci krevních destiček. Agregace krevních destiček zprostředkovaná PAR-1 může být přechodná a reverzibilní, pokud není posílena další signalizací ze sekretovaného ADP přes P2Y12 z receptoru PAR-4. DAG označuje diacylglycerol IP3, inositol 1,4,5-trifosfát PI3K, fosfotidylionisitol 3-kinázu Tx A2tromboxan A2 a VASP, vasodilatátorem stimulovaný fosfoprotein.

PAR-4, trombinový receptor destiček s nízkou afinitou s vysoce prodlouženým signálem, přispívá k ireverzibilní agregaci destiček. 17 PAR-4 má délku 385 aminokyselin a postrádá sekvenci podobnou hirudinu a váže se na aktivní místo trombinu prostřednictvím negativně nabitého shluku aminokyselinových zbytků (aniontový shluk), což má za následek prodloužení disociace trombinu z receptoru . Přes nižší afinitu a pomalejší intracelulární signalizaci vede aktivace PAR-4 k většině mobilizace vápníku a trvalé aktivaci glykoproteinu IIb/IIIa indukované trombinem. Na rozdíl od PAR-1 vede aktivace PAR-4 k nevratné agregaci krevních destiček, a to i při absenci ADP-autokrinní odpovědi. 17 Pomocí metod Western blotting a koimunoprecipitace bylo prokázáno, že PAR-1 a PAR-4 se v lidských krevních destičkách vyskytují jako stabilní heterodimerní komplex a umožňují trombinu působit jako bivalentní funkční agonista a zprostředkovávat intracelulární signalizaci v nízkých i vysokých koncentracích. Dostupné údaje naznačují, že po navázání trombin štěpí PAR-1 a poté štěpí PAR-4, zatímco je stále navázán na PAR-1. Aktivace kteréhokoli PAR je dostatečná ke spuštění sekrece a agregace krevních destiček, zatímco PAR-1 je pravděpodobně fyziologicky relevantnějším receptorem pro řízení hemostázy.

Mechanismy, které regulují aktivitu PAR, jsou složité. PAR může být aktivován buď proteinázami prostřednictvím výše uvedeného mechanismu tetherovaného ligandu nebo prostřednictvím nekanonického mechanismu, kde ke štěpení proteinázou dochází v místě odlišném od kanonického místa štěpení. Proteázy, aktivovaný protein C, plasmin, matrix metaloproteáza-1 (MMP-1), MMP-13 a kalikrein štěpí PAR-1 v nekanonických místech štěpení odlišných od cíle Arg 41 trombinu, i když se sníženou účinností, když ve srovnání s trombinem. 61 Uvázaný ligand může také stimulovat signalizaci prostřednictvím dráhy nezávislé na G-proteinu, která zahrnuje vytvoření internalizovaného signálního skeletu zprostředkovaného β arestinem (viz níže). 8,9 Štěpení PAR na C-konci klasické sekvence tetherovaného ligandu může trvale odzbrojit receptor nebo vést k alternativní zkreslené signalizaci. Odzbrojení signalizace indukované specifickou proteázou tedy může být také spojeno s aktivací prostřednictvím dráhy MAP kinázy v nepřítomnosti mobilizace Ca++. 8

V tomto ohledu bylo prokázáno, že PAR receptory mají schopnost aktivovat jednu signální dráhu přednostně před jinou, což je proces známý jako funkční selektivita nebo zkreslený agonismus. Tyto vychýlené receptorové signální dráhy nebo funkční selektivita spojená s nekanonickým štěpením PAR-1 receptorů jsou selektivní pro intracelulární signalizaci spojenou buď s klasickými G-proteinovými cestami nebo β-arestiny, které mohou aktivovat mitogenem aktivované proteinkinázy nebo PI3K. 8 Kromě internalizace a desenzibilizace GPCR tedy mohou β-arestiny iniciovat intracelulární signalizační události, které jsou nezávislé na spojení a aktivaci G-proteinu.

Expozice krevních destiček fibrilárnímu kolagenu a následná konverze pro-MMP-1 zymogenu vázaného na krevní destičky na aktivní MMP-1 také podporuje agregaci krevních destiček prostřednictvím PAR-1 expozicí odlišného ligandu, PR-SFLLRN. Interakce MMP1–PAR-1 je nová cesta aktivace krevních destiček, která může hrát důležitou roli během raných fází interakcí destička-cévní stěna. Analýzy signálních drah G-proteinu naznačují, že MMP-1 a ligand PR-SFLLRN jsou zkreslení agonisté, kteří přednostně aktivují G12/13a že trombin přednostně aktivuje Gq v lidských krevních destičkách. 61 Aktivace G12/G13 vede k Rho-dependentní změně tvaru krevních destiček a sekreci granulí. Intracelulární signalizační události po aktivaci Gq jsou popsány výše. Na rozdíl od jiných GPCR, které se po internalizaci recyklují, je internalizovaný receptor PAR-1 po jediné aktivaci zaměřen na lysozomy pro degradaci prostřednictvím β-arestinu. 9

V několika preklinických studiích antagonismus PAR-1 neprodloužil čas krvácení nebo čas související s koagulací (aktivovaný parciální tromboplastinový čas, protrombinový čas nebo trombinový čas), což naznačuje, že inhibice PAR-1 zřejmě neinterferuje s normální hemostázou. 58 Navzdory vazbě na podobné G proteiny hrají PAR-1 a PAR-4 odlišné role při trombóze a hemostáze. Bylo prokázáno, že krevní destičky stimulované peptidem aktivujícím PAR-4 uvolňují více mikročástic a prokoagulační faktor V a jsou spojeny s vyšší hustotou faktoru V na aktivovaném povrchu krevních destiček ve srovnání se stimulací PAR-1. 62 Jiná studie však prokázala, že aktivace krevních destiček vyvolaná SFLLRN (PAR-1 agonistou) je spojena s rychlejší stimulací prokoagulační aktivity krevních destiček, jak bylo měřeno pomocí vazebných a koagulačních testů annexinu V, ve srovnání se stimulací PAR-4 pomocí GYPGQV. 63 Proto v tuto chvíli stále není jasné, která cesta, trombin PAR-1/PAR-4 nebo ADP-P2Y12 převládá u prokoagulační odpovědi krevních destiček a může se lišit mezi jednotlivci a etniky/rasami.

Interakce mezi PAR a P2Y12

Úzká synergická interakce mezi PAR a P2Y12 v krevních destičkách může být rozhodující pro rozvoj stabilní tvorby trombu a výsledných nežádoucích příhod. Ukázalo se, že agregace krevních destiček zprostředkovaná PAR-1 je přechodná, pokud není posílena dodatečným signálním vstupem z P2Y12 nebo PAR-4. 17 Stále není zcela jasné, zda křížová komunikace mezi PAR-1 a Gi drah probíhá pouze prostřednictvím P2Y12 signalizace. 64 PAR-1 antagonismus neinhiboval ADP-, U6441- nebo kolagenem indukovanou agregaci krevních destiček ve studiích na zvířatech a nebyly zjištěny žádné významné účinky na agregaci krevních destiček indukovanou peptidem aktivátoru trombinového receptoru po podání nasycovací dávky aspirinu a klopidogrelu u pacientů s koronární onemocnění tepen podstupující stentování. 65,66

Mechanismy aktivace Akt indukované trombinovými receptory versus P2Y12 se liší, ale jsou synergické a přispívají ke stabilizaci trombů bohatých na krevní destičky. Kromě dříve popsané heterodimerní interakce mezi PAR-1 a PAR-4 bylo nedávno prokázáno, že P2Y12 signalizace může být nezbytná pro aktivaci Akt zprostředkovanou PAR-4 a nábor arestinů do PAR-4/P2Y12 signální komplexy. Nábor arestinů do posledně uvedeného komplexu vede k začlenění Lyn, následné fosforylaci Akt závislé na PI3K, aktivaci glykoproteinu IIb/IIIa a stabilizaci trombů krevních destiček. 10 V přítomnosti silného P2Y12 blokáda, jako je indukovaná tikagrelorem a prasugrelem, a nízké koncentrace trombinu, mohou mít výše uvedená zjištění klinický význam s ohledem na zvýšení antitrombotické účinnosti přidáním inhibitoru PAR.

Inhibice PAR

Ukázalo se, že inhibice interakce mezi trombinem a PAR-1 zmírňuje ischemické příhody u vybraných pacientů léčených duální protidestičkovou terapií. Bylo vyvinuto několik inhibitorů PAR-1 včetně SCH 530348 (vorapaxar), E5555, FR-17113, F16618, F16357, PZ-128, RWJ-56110 a RWJ-58259 a BMS-200261. 67 Vývoj E5555 (atopaxar) byl ukončen.

Bylo prokázáno, že antagonisté připoutaného ligandu PAR-4, transcinnamoyl-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-NH a YD-3 (1-benzyl-3(ethoxykarbonylfenyl)-indazol) inhibují GYPGKF (agonista PAR-4) – indukovaná agregace promytých lidských krevních destiček se žádným nebo jen malým účinkem na agregaci krevních destiček vyvolanou trombinem, SFLLRN, kolagenem nebo U46619. 68 RWJ-56110, silný antagonista PAR-1, inhiboval nízkou (0,05 U/ml), ale ne vysokou koncentraci trombinem indukovanou agregaci krevních destiček, zatímco YD-3 samotný měl malý nebo žádný účinek na trombinem indukovanou agregaci krevních destiček, ale významně zvýšily antiagregační aktivitu antagonisty PAR-1. Tyto údaje naznačují, že k výrazné inhibici trombinu a destiček je nutná inhibice PAR-1 i PAR-4. 69

Myší model knockout PAR může poskytnout nepřímý důkaz důležitosti inhibice PAR jako antitrombotické strategie. Myší krevní destičky exprimují PAR-3 a PAR-4, ale ne PAR-1. Existují určité důkazy, které naznačují, že krevní destičky PAR-3 knockout myší mohou být analogické lidským krevním destičkám inhibovaným PAR-1. Myši s deficitem PAR-3 jsou však částečně chráněny před trombózou, zatímco myši s deficitem PAR-4 jsou zcela chráněny před trombózou. Tato data naznačují, že nekompletní blokáda trombinem indukované signalizace může stále poskytovat antitrombotický účinek. U primátů jiných než člověk, kteří exprimují PAR-1 a PAR-4 jako lidé, blokáda PAR-1 snížila trombotické příhody karotid. 70 Celkově vzato mohou být tyto údaje relevantní pro zvažování samotné terapie PAR-1 jako antitrombotické strategie. Klinické použití duální inhibice PAR-1 a PAR-4 ve srovnání se samotným PAR-1 zůstává v současné době stále neznámé.

Vorapaxar je vysokoafinitní antagonista PAR-1, který inhibuje PAR-1 kompetitivním a pomalu reverzibilním způsobem. 58 Na základě analýzy krystalové struktury jsme nedávno odhalili, že vazebné místo vorapaxaru se nachází těsně u extracelulárního povrchu receptoru na rozdíl od jiných ligandů pro GPCR, které pronikají hlouběji do transmembránového jádra receptoru.Bylo navrženo, že jedinečná interakce mezi vorapaxarem a PAR-1 vede k uzavření vazebné kapsy po navázání vorapaxaru, který může být odpovědný za nízkou rychlost disociace vorapaxaru a zpožděný posun farmakodynamických vlastností. 71 Vorapaxar zabraňuje vysokoafinitní vazbě uvázaného ligandu na vazebné místo pro ligand.

Ve studiích fáze I a II vorapaxar specificky a účinně inhiboval aktivitu PAR-1 destiček bez ovlivnění odpovědi na jiné agonisty receptoru a neměl žádný vliv na parametry koagulace. Vorapaxar významně inhiboval funkci krevních destiček po dobu ≤ 3 týdnů (plazmatický poločas 5–11 dní) po jednorázové nasycovací dávce. 58 Nedávno byl vorapaxar schválen Food and Drug Admistration ke snížení rizika infarktu myokardu, cévní mozkové příhody, kardiovaskulární smrti a revaskularizace u pacientů s předchozím infarktem myokardu nebo onemocněním periferních tepen. 72 Interakce trombin–PAR-1 může být také klíčová pro udržení vaskulární integrity v centrálním nervovém systému, orgánu bohatém na tkáňový faktor podporující hemostázu. Chronická inhibice tohoto vrozeného obranného mechanismu u pacientů s předchozí ischemickou nekrózou centrálního nervového systému může mít nežádoucí důsledky.

Inhibice interakce PAR-1 a G-proteinu

Inhibitory trombinu, jako je bivalirudin, účinně potlačují aktivaci krevních destiček závislou na PAR-1, avšak přímá inhibice trombinu může potenciálně zvýšit krvácení u pacientů podstupujících PCI, protože také interferuje s aktivací trombinového receptoru PAR-4 a hemostázou závislou na fibrinogenu. 73,74 Schopnost rychle a reverzibilně inhibovat signalizaci PAR-1 parenterální strategií se zdá být ideální u vysoce rizikových pacientů podstupujících PCI a může být spojena s menším rizikem krvácení při neočekávané operaci. 67 Rychle působící pepducin s krátkým poločasem rozpadu, PZ-128, je v současné době hodnocen ve studii fáze I u člověka (NCT01806077). Pepduciny jsou lipidované peptidy, které cílí na cytoplazmatický povrch jejich příbuzného receptoru. PZ-128 se skládá ze 7 aminokyselinového peptidu odvozeného z třetí intracelulární smyčky PAR-1 a je konjugován s palmitátovým lipidem. 60,75,76 PZ-128 přerušuje signalizaci vnitřně umístěným G proteinům. Bylo zjištěno, že struktura PZ-128 napodobuje off-state odpovídající intracelulární oblasti PAR-1, která je kritická pro spojení s G proteiny. PZ-128 rychle a reverzibilně inhibuje aktivaci krevních destiček a arteriální trombózu u morčat a primátů bez ovlivnění krvácení nebo jiných koagulačních parametrů. Vynikající inhibice agregace krevních destiček indukované PAR-1 a arteriální trombózy v závislosti na dávce a koncentraci byla spojena s podáváním pepducinu u paviánů. 77 Inhibice PAR-1 pomocí PZ-128 byla reverzibilní, jak dokazuje ztráta inhibice při vyšších koncentracích agonisty SFLLRN v dávkách 3 i 6 mg/kg. Podávání PZ-128 nebylo spojeno s významnou inhibicí odpovědi krevních destiček ADP ani PAR-4 (0 %–10 %) v žádném časovém bodě, včetně 1, 2 nebo 24 hodin. 77 Dávkově závislá ochrana proti arteriální trombóze s EC50 0,075 mg/kg PZ-128 byla stanovena u morčete a synergické ochranné účinky byly pozorovány u perorálního klopidogrelu. Farmakokinetické a protidestičkové farmakodynamické vlastnosti PZ-128 ukazují, že tento lipopeptid dosahuje maximální aktivity během (<15 minut) a bezprostředně po intravenózní infuzi a je zcela eliminován z plazmy během 24 hodin. PZ-128 neměl žádný vliv na parametry krvácení nebo koagulace u primátů nebo v krvi pacientů podstupujících PCI. 77

Jiné GPCR receptory

Tromboxan A2 receptor (TP) je dalším důležitým receptorem krevních destiček spojeným s amplifikací aktivace a agregace krevních destiček. TP se skládá z 342 aminokyselin a existuje 1000 receptorů na destičku. TP je spojen s Gq a G12 aktivace vedoucí k intracelulární mobilizaci Ca 2+, změně tvaru destiček a agregaci (viz výše). Bylo hlášeno, že v přítomnosti silného P2Y12 inhibice, přidaný protidestičkový účinek aspirinu je méně výrazný (viz výše). V této souvislosti je v současné době zájem o vypuštění koterapie aspirinem, aby se snížilo krvácení potencované gastrointestinální blokádou COX-1 a aby se snížily potenciální protrombotické účinky blokády COX-1 na CHZO.2 produkce, když je silný P2Y12 používá se inhibiční terapie. Blokáda tromboxanu A2 syntéza a TP receptor jsou strategie, které odstraňují rizika spojená s blokádou COX-1.

Terutroban, selektivní perorálně aktivní antagonista TP, je v klinickém vývoji pro použití v sekundární prevenci trombotických příhod. Terutroban byl spojen s podobnou úrovní inhibice agregace krevních destiček indukované kyselinou arachidonovou a kolagenem jako aspirin u pacientů s onemocněním periferních tepen a byl lepší než aspirin v inhibici agregace krevních destiček a tvorby trombu v ex vivo modelu trombózy. 78,79 Klinická studie fáze III, PERFORM (Prevence cerebrovaskulárních a kardiovaskulárních příhod ischemického původu pomocí teRutrobanu u pacientů s anamnézou ischemické cévní mozkové příhody nebo tranzientního ischemického ataku), však neprokázala v sekundární prevenci lepší účinek terutrobanu než aspirinu. cerebrovaskulárních a kardiovaskulárních příhod u ≈20 000 pacientů s cévní mozkovou příhodou. 80

Ridogrel, kombinovaný antagonista tromboxansyntázy a TP receptoru, byl spojen s podobnou angiografickou průchodností a primárním koncovým bodem (TIMI [trombolýza při infarktu myokardu] stupně 2 a 3) ve srovnání s aspirinem u pacientů s infarktem myokardu, kteří dostávali streptokinázu v RAPT ( Ridogrel Versus Aspirin Patency Trial). 81 Další nový kombinovaný tromboxan A2 inhibitor receptoru a syntázy, terbogrel je studován pro dlouhodobou antitrombotickou léčbu. 82

Downstream intracelulární signalizační cíle

Ačkoli intracelulární signální molekuly mohou poskytovat důležité cíle pro antitrombotické terapie, jejich široce rozšířená přítomnost v různých buňkách a poměrně méně dostupné genetické knockout modely brání výzkumu v této oblasti oproti studiu přímých inhibitorů GPCR. Je však třeba vzít v úvahu několik faktorů. V případě PI3Ky je exprese hlavně na hematopoetických buňkách a PI3Ky se může přednostně asociovat se specifickými podjednotkami Ga a Gβγ. Protože intracelulární signalizace krevních destiček má rozsáhlou redundanci, inhibice PI3Ky může poskytnout méně agresivní protidestičkový přístup než přímá inhibice upstream na samotném GPCR.

Inhibitory PI3Kp

Bylo ukázáno, že inhibitory PI3Kp inhibují in vitro agregaci krevních destiček a také tvorbu trombu in vivo. 83,84 AZD6482, inhibitor PI3Kp byl spojen s rychlým nástupem účinku a krátkým poločasem inhibice agregace krevních destiček na zvířecích modelech au lidí. Kromě toho byla 3hodinová parenterální infuze AZD6482 u lidí dobře tolerována a nedošlo k žádné změně v době krvácení. Velkým problémem je však potenciální vliv na inzulínovou signalizaci. Bylo navrženo, že AZD6482 může být účinným reverzibilním činidlem při léčbě pacientů podstupujících kardiopulmonální bypass a mrtvici k inhibici aktivace krevních destiček. 85

Gq inhibitory

Ačkoli bylo prokázáno, že YM-254890, nový inhibitor Gq signalizace, inhibuje ADP-indukovanou agregaci krevních destiček, což naznačuje potenciální klinickou roli inhibitorů Gq signalizace, druhý přístup může mít nepříznivé účinky na více orgánů, protože má široký vliv na mnoho GPCR cesty. 86

Závěry

V posledních 10 letech výzkum biologie destičkových receptorů výrazně pokročil s lepším pochopením signálních mechanismů indukovaných důležitými agonisty destiček. ADP-P2Y12tromboxan A2Interakce -TP a trombin-PAR-1/-PAR-4 jsou důležité dráhy zprostředkované GPCR spojené s aktivací a agregací krevních destiček. Relativní příspěvek těchto cest k trombóze in vivo zůstává oblastí velkého zájmu a je přímo relevantní pro vývoj budoucích protidestičkových strategií.

Současná inhibice ADP-P2Y12 cesta s klopidogrelem a cesta COX-1 s aspirinem byly hlavní strategií léčby pacientů s vysoce rizikovým onemocněním koronárních tepen. Přibývající důkazy prokázaly, že odpověď krevních destiček na tromboxan A2 a trombin je silně ovlivněn P2Y12 signalizace. Tato data naznačují potenciální hlavní roli pro silný P2Y12 monoterapie inhibitorem v léčbě vysoce rizikových kardiovaskulárních onemocnění.

Strop čistého klinického přínosu spojený s aspirinem a silným P2Y12 blokátory receptorů naznačuje potenciální potřebu cílení alternativních cest aktivace krevních destiček. Jednou z cest, která byla v poslední době zacílena, je receptor PAR-1 u vorapaxaru. Rychlá inhibice trombinem indukované aktivace destiček je pravděpodobně důležitá pro zmírnění tvorby trombu destiček ve stavech vysokého průtoku krve přítomných v arteriálním řečišti. Údaje in vivo ze studií na zvířatech podporují antitrombotický účinek samotné inhibice PAR-1 a zesílení antitrombotického účinku P2Y12 a inhibice COX-1 přidáním blokády PAR-1. Agregace krevních destiček zprostředkovaná PAR-1 je přechodná, pokud není posílena dodatečným signálním vstupem z P2Y12 a PAR-4. Tato data naznačují potenciální budoucí klinickou roli kombinovaných PAR-1 a P2Y12 inhibice a kombinovaná inhibice PAR-1 a PAR-4. Zacílení na tromboxansyntázu nebo TP receptor nebylo klinicky přesvědčivě účinnější než aspirin, pravděpodobně kvůli prospěšným účinkům aspirinu, které nejsou zprostředkované COX-1. A konečně, experimentální důkazy podporují potenciální interakci mezi vysokými dávkami aspirinu a naposledy schváleným silným P2Y12 inhibitor tikagrelor, účinek, který lze vysvětlit působením PGI2 a tikagrelor na jejich příslušných GPCR. Zacílení intracelulární signalizace downstream od receptorů GPCR pomocí inhibitorů PI3K a Gq patří mezi nové strategie, které jsou předmětem výzkumu, aby se zabránilo výskytu arteriální ischemické příhody. Větší pochopení mechanismu signalizačních událostí GPCR u jednotlivého pacienta může umožnit přizpůsobení protidestičkové terapie.

Stůl. Charakteristika důležitých blokátorů receptorů spojených s G-proteinem

CPTP označuje cyklopentyltriazolopyrimidin a PAR-1, proteázou aktivovaný receptor-1.


Signální molekuly

Signální molekuly jsou nezbytné pro koordinaci buněčných odpovědí tím, že slouží jako ligandy a vážou se na buněčné receptory.

Učební cíle

Porovnejte a porovnejte různé typy signálních molekul: hydrofobní, ve vodě rozpustné a plynné ligandy

Klíčové věci

Klíčové body

  • Signální molekuly se mohou pohybovat od malých proteinů po malé ionty a mohou být hydrofobní, rozpustné ve vodě nebo dokonce plynné.
  • Hydrofobní signální molekuly (ligandy) mohou difundovat plazmatickou membránou a vázat se na vnitřní receptory.
  • Ve vodě rozpustné ligandy nejsou schopny volně procházet plazmatickou membránou kvůli své polaritě a musí se vázat na extracelulární doménu receptoru buněčného povrchu.
  • Jiné typy ligandů mohou zahrnovat plyny, jako je oxid dusnatý, které mohou volně difundovat plazmatickou membránou a vázat se na vnitřní receptory.

Klíčové výrazy

  • ligand: iont, molekula nebo funkční skupina, která se váže na jinou chemickou entitu za vzniku většího komplexu
  • hydrofobní: postrádající afinitu k vodě neschopnou absorbovat nebo být vodou smáčen

Signální molekuly

Ligandy, produkované signalizačními buňkami a následnou vazbou na receptory v cílových buňkách, působí jako chemické signály, které putují do cílových buněk, aby koordinovaly reakce. Typy molekul, které slouží jako ligandy, jsou neuvěřitelně rozmanité a sahají od malých proteinů po malé ionty, jako je vápník (Ca2+).

Malé hydrofobní ligandy

Malé hydrofobní ligandy mohou přímo difundovat plazmatickou membránou a interagovat s vnitřními receptory. Důležitými členy této třídy ligandů jsou steroidní hormony. Steroidy jsou lipidy, které mají uhlovodíkový skelet se čtyřmi fúzovanými kruhy různé steroidy mají různé funkční skupiny připojené k uhlíkovému skeletu. Steroidní hormony zahrnují ženský pohlavní hormon, estradiol, což je typ estrogenu, mužský pohlavní hormon, testosteron a cholesterol, který je důležitou strukturální složkou biologických membrán a prekurzorem steroidních hormonů. Mezi další hydrofobní hormony patří hormony štítné žlázy a vitamin D. Aby byly hydrofobní ligandy rozpustné v krvi, musí se vázat na nosné proteiny, zatímco jsou transportovány krevním řečištěm.

Steroidní hormony: Steroidní hormony mají podobnou chemickou strukturu jako jejich prekurzor, cholesterol. Protože jsou tyto molekuly malé a hydrofobní, mohou difundovat přímo přes plazmatickou membránu do buňky, kde interagují s vnitřními receptory.

Ligandy rozpustné ve vodě

Ve vodě rozpustné ligandy jsou polární, a proto někdy nemohou projít plazmatickou membránou bez pomoci, jsou příliš velké na to, aby membránou vůbec prošly. Místo toho se většina ve vodě rozpustných ligandů váže na extracelulární doménu receptorů buněčného povrchu. Receptory buněčného povrchu zahrnují: iontový kanál, G-protein a proteinové receptory spojené s enzymem. Vazba těchto ligandů na tyto receptory vede k řadě buněčných změn. Tyto ve vodě rozpustné ligandy jsou velmi rozmanité a zahrnují malé molekuly, peptidy a proteiny.

Jiné Ligandy

Oxid dusnatý (NO) je plyn, který také působí jako ligand. Je schopen difundovat přímo přes plazmatickou membránu, jednou z jeho rolí je interakce s receptory v hladkém svalstvu a navození relaxace tkáně. NO má velmi krátký poločas rozpadu, proto funguje pouze na krátké vzdálenosti. Nitroglycerin, léčba srdečních onemocnění, působí tak, že spouští uvolňování NO, což způsobuje dilataci (rozšiřování) krevních cév, čímž se obnovuje průtok krve do srdce.


Pochopení GPCR zkreslené signalizace prostřednictvím struktur G proteinu a arestinového komplexu

Je zhodnocen nedávný pokrok ve strukturálních studiích GPCR signálních komplexů.

Agonistická vazba indukuje otevření TM6 a intracelulární kapsu GPCR.

Pro GPCR je vyžadována otevřená intracelulární kapsa k náboru signálních partnerů.

Nábor arestinu vyžaduje fosforylovaný C-koncový konec receptoru.

Vychýlené ligandy indukují GPCR konformace pro vazbu specifických signálních partnerů.

Receptory spojené s G proteinem (GPCR) jsou největší rodinou buněčných povrchových receptorů a jsou důležitými cíli léčiv pro mnoho lidských onemocnění. Určení 3-D struktury GPCR a jejich signálních komplexů podpořilo naše pochopení biologie GPCR a poskytlo šablony pro objevování léků na základě struktury. V tomto přehledu se zaměřujeme na nedávnou strukturní práci na signálních komplexech GPCR, konkrétně na komplexech β2-adrenoreceptor-G a rhodopsin-arestin, a zdůrazňujeme strukturální rysy komplexů GPCR zapojených do přenosu signálu zprostředkovaného G proteinem a arestinem. . Krystalové struktury odhalují odlišné strukturální mechanismy, kterými GPCR rekrutují G protein a arestin. Srovnání těchto dvou komplexních struktur poskytuje pohled na molekulární mechanismus funkčně selektivní signalizace GPCR a strukturální základ pro objev léčby lidských onemocnění souvisejících s transdukcí signálu GPCR ovlivněné G proteinem a arestinem.


Vztah mezi signalizací G proteinu a homologní desenzibilizací receptorů spřažených s G proteinem

Signalizace a desenzibilizace receptoru spřaženého s G proteinem spolu úzce souvisí a jejich samostatné měření vyžaduje určité parametry, které představují desenzibilizaci nezávisle na signalizaci. V této studii jsme testovali, zda desenzibilizace vyžaduje signalizaci na třech různých receptorech, beta2-adrenergním receptoru (beta2AR) v lymfomových buňkách S49, alfa-faktorovém feromonovém receptoru (Ste2p) v buňkách Saccharomyces cerevisiae LM102 a dopaminovém D3 receptoru (D3R) v HEK -293 buněk. Agonistou indukovaná translokace beta-arestinu do plazmatické membrány nebo sekvestrace receptoru byla měřena pro odhad homologní desenzibilizace. K oddělení signalizace a desenzibilizace beta2AR, která zprostředkovává stimulaci adenylylcyklázy, byly použity cys-buňky lymfomu S49, které postrádají alfa podjednotku Gs. Stimulace beta2AR v těchto buňkách selhala při zvýšení intracelulárního cAMP, ale translokace beta-arestinu stále probíhala, což naznačuje, že zpětná vazba ze signalizace beta2AR není nutná pro homologní desenzibilizaci. Agonistou indukovaná sekvestrace kvasinky Ste2p-L236R, která vykazovala sníženou signalizaci prostřednictvím G proteinu, se nelišila od sekvestrace divokého typu Ste2p, což naznačuje, že receptorová signalizace a sekvestrace nejsou přímo spojené buněčné události. Jak spojení G proteinu, tak signalizace D3R, měřená jako inhibice produkce cAMP, byly značně zesíleny koexpresí exogenní alfa podjednotky Go (Goalpha) nebo adenylyl cyklázy typu 5 (AC5), v daném pořadí. Avšak agonistou indukovaná translokace beta-arestinu, fosforylace receptoru a sekvestrace nebyly ovlivněny společnou expresí Galphao a AC5, což naznačuje, že rozsah signalizace neurčuje intenzitu desenzibilizace. Celkově naše výsledky konzistentně naznačují, že signalizace G proteinu a homologní desenzibilizace jsou nezávislé buněčné procesy.


Reference

Blake DR, Allen R. Zánět: základní principy a klinické koreláty. Ann Rheum Dis. 198847:792.

Serhan CN, Levy BD. Resolviny při zánětu: vznik pro-řešící superrodiny mediátorů. J Clin Invest. 2018128:2657–69.

Bacchi S, Palumbo P, Sponta A, Coppolino MF. Klinická farmakologie nesteroidních protizánětlivých léků: přehled. Antiinflamm Antiallergy Agents Med Chem. 201211:52–64.

Perez DM. Od rostlin k člověku: GPCR „strom života“. Mol Pharmacol. 200567:1383–4.

Ley K, Hoffman HM, Kubes P, Cassatella MA, Zychlinsky A, Hedrick CC a kol. Neutrofily: nové poznatky a otevřené otázky. Sci Immunol. 20183:eaat4579.

Ye RD, Boulay F, Wang JM, Dahlgren C, Gerard C, Parmentier M a kol. Mezinárodní unie základní a klinické farmakologie. LXXIII. Nomenklatura pro rodinu formylpeptidových receptorů (FPR). Pharmacol Rev. 200961:119–61.

Ricciotti E, FitzGerald GA. Prostaglandiny a záněty. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 201131:986–1000.

Ollivier V, Parry GC, Cobb RR, de Prost D, Mackman N. Zvýšený cyklický AMP inhibuje transkripci zprostředkovanou NF-kappaB v lidských monocytárních buňkách a endoteliálních buňkách. J Biol Chem. 1996271:20828–35.

Fan J, Ye RD, Malik AB.Transkripční mechanismy akutního poškození plic. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2001281:L1037–50.

Grabiner BC, Blonska M, Lin PC, You Y, Wang D, Sun J a kol. Nedostatek CARMA3 ruší NF-indukované receptorem spřaženým s G proteinemB aktivace. Genes Dev. 200721:984–96.

Ty RD. Regulace aktivace jaderného faktoru kappaB receptory spřaženými s G-proteinem. J Leukoc Biol. 200170:839–48.

Serhan CN. Pro-rozlišovací lipidové mediátory jsou vodítka pro fyziologii rozlišení. Příroda. 2014510:92–101.

Dalli J, Zhu M, Vlasenko NA, Deng B, Haeggstrom JZ, Petasis NA, et al. Nový 13S,14S-epoxy-maresin je konvertován lidskými makrofágy na maresin 1 (MaR1), inhibuje leukotrien A4 hydrolázu (LTA4H) a posouvá fenotyp makrofágů. FASEB J. 201327:2573–83.

Moore KW, de Waal Malefyt R, Coffman RL, O'Garra A. Interleukin-10 a receptor interleukinu-10. Annu Rev Immunol. 200119:683–765.

Fiore S, Maddox JF, Perez HD, Serhan CN. Identifikace lidské cDNA kódující funkční receptor lipoxinu A4 s vysokou afinitou. J Exp Med. 1994180:253–60.

Chiang N, Fierro IM, Gronert K, Serhan CN. Aktivace lipoxinových A(4) receptorů lipoxiny spouštěnými aspirinem a vybranými peptidy vyvolává ligandově specifické odpovědi při zánětu. J Exp Med. 2000191:1197–208.

Chiang N, Serhan CN. Strukturní objasnění a fyziologické funkce specializovaných pro-resolvujících mediátorů a jejich receptorů. Mol Asp Med. 201758:114–29.

Chiang N, Dalli J, Colas RA, Serhan CN. Identifikace receptoru resolvinu D2 zprostředkujícího řešení infekcí a ochranu orgánů. J Exp Med. 2015212:1203–17.

Bang S, Xie YK, Zhang ZJ, Wang Z, Xu ZZ, Ji RR. GPR37 reguluje fagocytózu makrofágů a řešení zánětlivé bolesti. J Clin Invest. 2018128:3568–82.

Chiang N, Libreros S, Norris PC, de la Rosa X, Serhan CN. Maresin 1 aktivuje imunoresolventní funkce fagocytů podporujících receptor LGR6. J Clin Invest. 2019129:5294–311.

Serhan CN, Hamberg M, Samuelsson B. Lipoxiny: nová řada biologicky aktivních sloučenin vytvořených z kyseliny arachidonové v lidských leukocytech. Proč Natl Acad Sci USA. 198481:5335–9.

Colgan SP, Serhan CN, Parkos CA, Delp-Archer C, Madara JL. Lipoxin A4 moduluje transmigraci lidských neutrofilů přes monovrstvy střevního epitelu. J Clin Invest. 199392:75–82.

Claria J, Serhan CN. Aspirin spouští dříve nepopsané bioaktivní eikosanoidy interakcí lidských endoteliálních buněk a leukocytů. Proč Natl Acad Sci USA. 199592:9475–9.

@Serhan CN. Lipoxiny a nové aspirinem spouštěné 15-epi-lipoxiny (ATL): džungle interakcí buňka-buňka nebo terapeutická příležitost? prostaglandiny. 199753:107–37.

Fiore S, Ryeom SW, Weller PF, Serhan CN. Místa rozpoznání lipoxinu. Specifická vazba značeného lipoxinu A4 s lidskými neutrofily. J Biol Chem. 1992267:16168–76.

Maddox JF, Hachicha M, Takano T, Petasis NA, Fokin VV, Serhan CN. Stabilní analogy lipoxinu A4 jsou silná mimetika, která stimulují lidské monocyty a buňky THP-1 prostřednictvím receptoru lipoxinu A4 spojeného s G-proteinem. J Biol Chem. 1997272:6972–8.

Maderna P, Cottell DC, Toivonen T, Dufton N, Dalli J, Perretti M a kol. Exprese a internalizace receptoru FPR2/ALX jsou rozhodující pro fagocytózu stimulovanou lipoxinem A4 a peptidem odvozeným od anexinu. FASEB J. 201024:4240–9.

Forsman H, Dahlgren C. Metabolity/analogy lipoxinu A(4) ze dvou komerčních zdrojů nemají žádné účinky na aktivaci nebo aktivaci TNF-alfa prostřednictvím receptorů formylového peptidu neutrofilů. Scand J Immunol. 200970:396–402.

Forsman H, Onnheim K, Andreasson E, Dahlgren C. Jaké formylpeptidové receptory, pokud vůbec nějaké, jsou spouštěny sloučeninou 43 a lipoxinem A4? Scand J Immunol. 201174:227–34.

Hanson J, Ferreiros N, Pirotte B, Geisslinger G, Offermanns S. Heterologně exprimovaný formylpeptidový receptor 2 (FPR2/ALX) nereaguje na lipoxin A(4). Biochem Pharm. 201385:1795–802.

Cooray SN, Gobbetti T, Montero-Melendez T, McArthur S, Thompson D, Clark AJ a kol. Ligandově specifická konformační změna receptoru spřaženého s G-proteinem ALX/FPR2 určuje proresolving funkční odpovědi. Proč Natl Acad Sci USA. 2013110:18232–7.

Su SB, Gong W, Gao JL, Shen W, Murphy PM, Oppenheim JJ a kol. Sedmitransmembránový receptor spřažený s G proteinem, FPRL1, zprostředkovává chemotaktickou aktivitu sérového amyloidu A pro lidské fagocytární buňky. J Exp Med. 1999189:395–402.

He R, Sang H, Ye RD. Sérový amyloid A indukuje sekreci IL-8 prostřednictvím receptoru spřaženého s G proteinem, FPRL1/LXA4R. Krev. 2003101:1572–81.

Ge Y, Zhang S, Wang J, Xia F, Wan JB, Lu J a kol. Duální modulace receptoru formylpeptidu 2 lipoxinem spouštěným aspirinem přispívá k jeho protizánětlivé aktivitě. FASEBJ. 202034:6920–33.

Hilger D, Masureel M, Kobilka BK. Struktura a dynamika signálních komplexů GPCR. Nat Struct Mol Biol. 201825:4–12.

Mills JS, Miettinen HM, Cummings D, Jesaitis AJ. Charakterizace vazebného místa na receptoru formylového peptidu pomocí tří receptorových mutantů a analogů Met-Leu-Phe a Met-Met-Trp-Leu-Leu. J Biol Chem. 2000275:39012–7.

Quehenberger O, Prossnitz ER, Cavanagh SL, Cochrane CG, Ye RD. Pro vazbu ligandu s vysokou afinitou je zapotřebí více domén N-formylpeptidového receptoru. Konstrukce a analýza chimérických N-formylpeptidových receptorů. J Biol Chem. 1993268:18167–75.

Quehenberger O, Pan ZK, Prossnitz ER, Cavanagh SL, Cochrane CG, Ye RD. Identifikace domény vázající ligand N-formylpeptidového receptoru přístupem zisku funkce. Biochem Biophys Res Commun. 1997238:377–81.

Mills JS, Miettinen HM, Barnidge D, Vlases MJ, Wimer-Mackin S, Dratz EA a kol. Identifikace vazebného místa ligandu v receptoru formylového peptidu lidského neutrofilu pomocí místně specifické fluorescenční fotoafinitní značky a hmotnostní spektrometrie. J Biol Chem. 1998273:10428–35.

On HQ, Troksa EL, Caltabiano G, Pardo L, Ye RD. Strukturní determinanty pro interakci formylpeptidového receptoru 2 s peptidovými ligandy. J Biol Chem. 2014289:2295–306.

Zhuang Y, Liu H, Edward Zhou X, Kumar Verma R, de Waal PW, Jang W a kol. Struktura komplexu formylpeptidového receptoru 2-Gi odhaluje vhled do rozpoznávání a signalizace ligandu. Nat Commun. 202011:885.

Chen T, Xiong M, Zong X, Ge Y, Zhang H, Wang M a kol. Strukturní základy vazebných režimů ligandu na lidském formylpeptidovém receptoru 2. Nat Commun. 202011:1208.

He M, Cheng N, Gao WW, Zhang M, Zhang YY, Ye RD a kol. Charakterizace Quin-C1 pro jeho protizánětlivé vlastnosti na myším modelu poškození plic vyvolaného bleomycinem. Acta Pharmacol Sin. 201132:601–10.

Nanamori M, Cheng X, Mei J, Sang H, Xuan Y, Zhou C a kol. Nový nepeptidový ligand pro formylpeptidový receptor podobný 1. Mol Pharmacol. 200466:1213–22.

Kao W, Gu R, Jia Y, Wei X, Fan H, Harris J a kol. Agonista receptoru formylového peptidu potlačuje zánět a poškození kostí při artritidě. Br J Pharmacol. 2014171:4087–96.

Burli RW, Xu H, Zou X, Muller K, Golden J, Frohn M a kol. Silní agonisté hFPRL1 (ALXR) jako potenciální protizánětlivá činidla. Bioorg Med Chem Lett. 200616:3713–8.

Qin CX, May LT, Li R, Cao N, Rosli S, Deo M a kol. Sloučenina 17b, agonista receptoru formylového peptidu ovlivněná malými molekulami, chrání před ischemicko-reperfuzním poškozením myokardu u myší. Nat Commun. 20178:14232.

Krishnamoorthy S, Recchiuti A, Chiang N, Yacoubian S, Lee CH, Yang R a kol. Resolvin D1 váže lidské fagocyty s důkazy pro proresolvingové receptory. Proč Natl Acad Sci USA. 2010107:1660–5.

Arnardottir HH, Dalli J, Norling LV, Colas RA, Perretti M, Serhan CN. Resolvin D3 je dysregulován u artritidy a snižuje artritický zánět. J Immunol. 2016197:2362–8.

Chiang N, Fredman G, Backhed F, Oh SF, Vickery T, Schmidt BA a kol. Infekce reguluje pro-řešící mediátory, které snižují požadavky na antibiotika. Příroda. 2012484:524–8.

Dalli J, Winkler JW, Colas RA, Arnardottir H, Cheng CY, Chiang N a kol. Resolvin D3 a aspirinem spouštěný resolvin D3 jsou silná imunorozpouštědla. Chem Biol. 201320:188–201.

Arita M, Bianchini F, Aliberti J, Sher A, Chiang N, Hong S a kol. Stereochemické přiřazení, protizánětlivé vlastnosti a receptor pro omega-3 lipidový mediátor resolvin E1. J Exp Med. 2005201:713–22.

Arita M, Ohira T, Sun YP, Elangovan S, Chiang N, Serhan CN. Resolvin E1 selektivně interaguje s receptorem leukotrienu B4 BLT1 a ChemR23 za účelem regulace zánětu. J Immunol. 2007178:3912–7.

Oh SF, Pillai PS, Recchiuti A, Yang R, Serhan CN. Pro-rozlišovací účinky a stereoselektivní biosyntéza 18S E-série resolvinů v lidských leukocytech a zánětu myší. J Clin Invest. 2011121:569–81.

Laskowski RA, Swindells MB. LigPlot + : mnohočetné diagramy interakce ligand-protein pro objev léků. Model J Chem Inf. 201151:2778–86.


Signalizace prostřednictvím receptoru spřaženého s G-proteinem Rickets je důležitá pro polaritu, oddělení a migraci hraničních buněk u Drosophila.

<p>Migrace buněk hraje klíčovou roli během vývoje. Vynikající model pro studium koordinovaných buněčných pohybů poskytuje migrace hraničních buněčných shluků ve vyvíjející se komoře vajíčka Drosophila. Ve screeningu mutageneze jsme izolovali dvě alely genové křivice (rk) kódující receptor spřažený s G-proteinem. Alely rk mají za následek defekty migrace hraničních buněk ve významné části vajíček. U mutantů rk jsou hraniční buňky správně specifikovány a exprimují marker Slbo. Přesto analýza fixních i živých vzorků odhalila, že některé jednotlivé hraniční buňky během migrace zaostávají za hlavním hraničním buněčným shlukem, nebo v jiných případech může celý hraniční buněčný shluk při migraci zůstat připoután k přednímu epitelu. Tyto defekty jsou pozorovány významně častěji v mozaikových hraničních buněčných shlucích než v plně mutantních shlucích. Redukce Rk ligandu, Bursicon, v hraničním buněčném shluku také vedla k migračním defektům, což silně naznačuje, že Rk signalizace je využívána pro komunikaci v samotném hraničním buněčném shluku. Shluky mutantních hraničních buněk vykazují defekty v lokalizaci adhezního proteinu E-cadherinu a proteinů apikální polarity během migrace. K chybné lokalizaci e-cadherinu dochází v mozaikových shlucích, ale ne v úplných mutantních shlucích, což dobře koreluje s fenotypem migrace buněk na hranici rk. Naše práce identifikovala receptor s dříve neznámou úlohou v migraci hraničních buněk, který zřejmě reguluje oddělení a polaritu koordinačních procesů klastru hraničních buněk uvnitř buněk samotného klastru.


Signalizace prostřednictvím receptorů spojených s G proteinem

Heterotrimerní G proteiny (podjednotky Gα, Gβ/Gγ) tvoří jednu z nejdůležitějších složek buněčné signální kaskády. G Protein Coupled Receptors (GPCRs) vnímají mnoho extracelulárních signálů a převádějí je na heterotrimerní G proteiny, které dále transdukují signály intracelulárně do příslušných downstream efektorů a hrají tak důležitou roli v různých signálních drahách. GPCR existují jako superrodina integrálních membránových proteinových receptorů, které obsahují sedm transmembránových a-helikálních oblastí, které se vážou na širokou škálu ligandů. Po aktivaci ligandem podstoupí GPCR konformační změnu a poté aktivuje G proteiny podporou výměny GDP/GTP asociovaného s podjednotkou Ga. To vede k disociaci Gp/Gy dimeru od Ga. Obě tyto části se pak stanou volnými, aby mohly působit na jejich downstream efektory a tím iniciovat jedinečné intracelulární signalizační reakce. Po šíření signálu je GTP z Gα-GTP hydrolyzován na GDP a Gα se stává neaktivním (Gα-GDP), což vede k jeho opětovnému spojení s dimerem Gβ/Gγ za vzniku inaktivního heterotrimerního komplexu. GPCR může také přenášet signál cestou nezávislou na G proteinu. GPCR také regulují progresi buněčného cyklu. Dosud jsou známy tisíce GPCR z živočišné říše s malou homologií mezi nimi, ale pouze jeden GPCR byl identifikován v rostlinném systému, o kterém bylo hlášeno, že je regulován buněčným cyklem a také se účastní ABA a signalizace stresu. Zde jsem popsal obecný mechanismus přenosu signálu přes GPCR/G proteiny, strukturu GPCR, rodinu GPCR a rostlinný GPCR a jeho roli.


Podívejte se na video: Calcium as a Second Messenger (Červenec 2022).


Komentáře:

  1. Dairan

    Precisely, you are right

  2. Dunris

    It should tell you you have been misled.

  3. Daijind

    the Relevant message :)

  4. Pierce

    All personal leave today?

  5. Audley

    Bravo, what phrase..., an excellent idea

  6. Mibar

    Well done, this is the simply beautiful idea



Napište zprávu