Informace

Při jaké síle g začnou bakterie peletovat v trubici?

Při jaké síle g začnou bakterie peletovat v trubici?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

pracuji s C. elegans a bakterií a já se chci zbavit bakterií, které jedí, odstředěním červů bez odstředění bakterií. Používám g-sílu 600 a bakterie se občas ještě odstředí. Jaká g-síla by byla ideální pro peletování červů, ale ne bakterií? Závisí to na druhu bakterií?


Centrifugace

Abstraktní

Centrifugace je metoda separace molekul s různou hustotou jejich rotací v roztoku kolem osy (v rotoru odstředivky) vysokou rychlostí. Je to jedna z nejužitečnějších a často používaných technik v molekulárně biologické laboratoři. Centrifugace se používá ke sběru buněk, k vysrážení DNA, k čištění virových částic a k rozlišení jemných rozdílů v konformaci molekul. Tato kapitola pojednává o relativní odstředivé síle ( G síla), jak převést G síla na otáčky za minutu (ot/min) a jak vypočítat dobu sedimentace částice během centrifugace.


Připravte zkumavky se vzorky

K extrakci vzorků DNA ze slin použijete zkumavky o objemu 1,5 ml.

Nejprve připravte každou zkumavku tak, že ji označíte permanentním fixem.

I když máte pouze jeden vzorek, je dobré zkumavku jasně označit. Pokud je vzorek například od osoby, můžete použít její iniciály. Je také dobré označit datum vzorku.

Připravte fyziologický roztok

Budete potřebovat slanou vodu (fyziologický roztok) jako ústní voda k zachycení vašich lícních buněk.

V malé skleničce nebo podobně smíchejte špetku kuchyňské soli s vodou. K tomu se skvěle hodí panák. Měření nemusí být přesné. Špetka soli na malý doušek vody je dobrým pravidlem.

Nemusíte dělat mnoho – stačí malý doušek.

Proč slaná voda? V tomto protokolu je cílem získat vzorek DNA z lícních buněk. Vaše sliny po vypláchnutí úst přirozeně obsahují lícní buňky, které se během protokolu rozlomí, aby se uvolnila DNA. Sůl, tj. chlorid sodný, se používá ke stabilizaci DNA, jakmile se uvolní.

Vyplachování úst

Nalijte slanou vodu do úst. Nepoužívejte příliš mnoho, stačí jen malý doušek. Důkladně si opláchněte vnitřní tváře po dobu 30-60 sekund. Až budete hotovi, vyplivněte fyziologický roztok do nové sklenice. (nebo pokud je sklenice, kterou jste použili k míchání slané vody, prázdná, můžete ji znovu použít).

Cílem tohoto kroku je uvolnit co nejvíce buněk z úst. Můžete použít zuby k jemnému škrábání tváří a jazyka, zatímco v ústech víříte slanou vodu. Jazykem se můžete dotknout i vnitřních tváří. Dejte si pozor, abyste si neublížili – není potřeba krev, jen sliny se spoustou lícních buněk.

Přeneste vzorek do mikrocentrifugační zkumavky

K tomuto kroku použijete vzorek slin (1), mikrocentrifugační zkumavku, kterou jste označili na začátku (2)a přenosovou pipetu (3).

Pomocí přenosové pipety přeneste vzorek slin do mikrocentrifugační zkumavky. Naplňte ji po značku 1,5 ml.

Odstředivka

Je čas použít odstředivku. To využije gravitační sílu ke koncentraci vzorku.

Vložte centrifugační zkumavku se vzorkem slin do centrifugy. Zajistěte vyvážení centrifugy s jiným vzorkem nebo s jiným protizávažím.

Pokud máte pouze jeden vzorek, nejjednodušší způsob, jak vyvážit centrifugu, je naplnit další zkumavku vodou a použít ji jako vyvažovací zkumavku.

Používání centrifugy nevyváženým způsobem je nebezpečné a způsobí poškození zařízení. Postupujte podle našich tipů pro vyvážení odstředivky v návodu zde. V tomto případě můžete například použít druhý vzorek jako protiváhu nebo naplnit další zkumavku vodou. Trubky musí být vždy vyváženy jinou trubkou stejné hmotnosti.

Jakmile je zkumavka se vzorkem vyvážena v rotoru centrifugy, zavřete víko a aktivujte modul centrifugy. Nastavte rychlost na 4 000 G a odstřeďte po dobu 90 sekund.

Obnova pelety

Po dokončení centrifugace zkontrolujte zkumavku se vzorkem. Všechny lícní buňky by nyní měly být soustředěny do malé bílé kuličky na dně zkumavky (1). Toto se nazývá a pelety. Zbývající kapalina (2), nazvaný supernatant, by mělo být jasné.

V tomto kroku odstraníte supernatant, takže zůstane pouze bílá peleta.
Zkontrolujte, zda je peleta pevně připojena ke dnu zkumavky. Pokud ano, můžete supernatant opatrně vylít.

Pokud peleta není pevně připojena ke dnu zkumavky, zkuste vzorek znovu točit v odstředivce, aby se připevnil ke dnu zkumavky. Pokud zůstane uvolněný, můžete použít mikropipetu s čerstvou špičkou k pomalému přenosu supernatantu ze zkumavky. Můžete také zkusit použít přenosovou pipetu, kterou jste použili dříve, ale může být obtížné ji ovládat a mohlo by dojít k narušení pelety.

Resuspendování pelety

Nyní byste měli mít ve zkumavce bílou peletu. Měla by být velká asi jako hlavička zápalky.

Pokud je vaše peleta menší než hlavička zápalky, možná nebudete mít dostatek lícních buněk k získání koncentrovaného vzorku DNA. V takovém případě se vraťte ke kroku 2 a koncentrujte další lícní buňky ze slin. Můžete použít stejnou zkumavku a jednoduše přidat další vzorek do stávající pelety.

Jakmile budete mít dostatečně velkou peletu, můžete buňky resuspendovat ve zbývající kapalině, která je stále ve zkumavce. Nyní máte koncentrovaný vzorek buněk v malém objemu kapaliny.
Ujistěte se, že je zkumavka uzavřená, a poté vmíchejte buňky z pelety do kapaliny švihnutím zkumavky. Buňky pelety jsou nyní resuspendovány v kapalině.

Převod

V tomto dalším kroku použijete mikropipetu (1) k přenesení resuspendovaného vzorku (2) do 0,2 ml PCR zkumavky (3), abyste jej mohli ohřát v termocykleru.

Nejprve nastavte nastavitelnou pipetu na maximální objem 20μl.

Ujistěte se, že pipeta má novou špičku pipety. Poté pomocí pipety přeneste buněčnou směs vzorku do 0,2 ml PCR zkumavky. Pokračujte, dokud nebude zkumavka PCR téměř plná nebo dokud nezůstane žádný vzorek. Přidejte co nejvíce buněčné směsi do zkumavky PCR.

Označení zkumavky PCR

Nakonec zaklapněte víčko PCR zkumavky a označte zkumavku pro identifikaci vzorku, podobně jako u centrifugační zkumavky.

Označte stranu zkumavek PCR, nikoli víčko. PCR stroj má vyhřívané víko, takže případný inkoust na víčku zkumavky se může uvolnit.

Zahřívání vzorku

V tomto kroku použijete termocykler jako tepelný blok k vaření buněk a jejich otevření, aby se uvolnila DNA do roztoku.

Umístěte zkumavku PCR s roztokem vzorku buněk do bloku termocykleru.

Nastavte termocykler tak, aby zahříval vzorek na 99 °C po dobu 10 minut.

Míchání vzorku

Po zahřátí vzorku po dobu 10 minut jej opět připravíme na centrifugaci.

Nejprve vyjměte zkumavku PCR z bloku termocykleru.

Blok a vyhřívané víko budou stále horké, proto dbejte zvýšené opatrnosti.

Promíchejte vzorek PCR zkumavkou po dobu 5 sekund.

Centrifugace vzorku

V tomto kroku roztočíte vzorek, abyste oddělili supernatant od buněčných zbytků. Nyní buňky praskly díky kroku zahřívání, DNA se z buněk uvolní a bude plavat v supernatantu.

Molekulová hmotnost DNA je lehčí než u jiného buněčného materiálu, jako jsou proteiny a buněčné stěny. Odstředěním vzorku odstředivkou oddělíme buněčný materiál od DNA, což nám poskytne čistší vzorek DNA.

Pro roztočení zkumavky PCR s vaším vzorkem (3) v mikrocentrifuze Bento Lab budete muset použít adaptér zkumavek PCR (1) která sedí v normální mikrocentrifugační zkumavce (2) a převede ji tak, aby se vešla do zkumavky PCR.

Nezapomeňte vyvážit centrifugu. Pokud tedy pracujete pouze s jedním vzorkem, připravte si další zkumavku PCR s množstvím vody ekvivalentním vašemu vzorku.

Nastavte centrifugu na 90 sekund při 8 kG.

Pokud potřebujete pomoc s ovládáním centrifugy Bento Lab, podívejte se do uživatelské příručky. Jakmile zavřete víko, vyberte režim času (1). Před potvrzením nastavte sílu (2) a čas (3).

Čištění vzorku pro uskladnění

Po centrifugaci byly všechny zbytky buněk vytlačeny na dno zkumavky PCR (1), přičemž v kapalném supernatantu zůstala pouze DNA (2). Supernatant by měl vypadat čirý, jako voda.

Nakonec přenesete supernatant do nové PCR pomocí mikropipety.

Nastavte mikropipetu na 20 μL a nasaďte novou špičku. Přeneste 40 μl čirého supernatantu do nové zkumavky pro PCR.

Buďte opatrní, abyste do nové zkumavky nepipetovali zbytky buněk. Měli byste přenášet pouze čirý tekutý supernatant. Vyhýbání se jakýmkoli buněčným úlomkům sníží možnost interference se vzorkem DNA.

Označování a skladování

Nová zkumavka nyní obsahuje pouze DNA v kapalině. Říká se tomu ukázka šablonya nyní mohou být dále použity pro analýzu pomocí protokolů, jako je PCR.

Zkumavku znovu označte, abyste mohli identifikovat, o jaký vzorek šablony se jedná.

Nakonec, pokud vzorek šablony hned nepoužíváte v jiném protokolu, uložte jej do mrazáku při teplotě kolem -20 °C. Tím se vzorek zachová.

I když je DNA sama o sobě velmi stabilní, ve vzorku mohou být stále nějaké další proteiny, které ji časem degradují. Účelem tohoto protokolu je co nejvíce vyčistit vzorek slin a zároveň zachovat DNA. Uložení vzorku v mrazáku zpomalí veškeré reakce zbylých proteinů, a proto bude vzorek templátové DNA uchován déle.


II. Zvýšení účinku gravitace: odstředivka.

Mnoho částic nebo buněk v kapalné suspenzi se po určité době nakonec usadí na dně nádoby vlivem gravitace (1 x g). Doba potřebná pro takové oddělení je však nepraktická. Jiné částice, extrémně malé velikosti, se v roztoku vůbec neoddělí, pokud nebudou vystaveny vysoké odstředivé síle. Když se suspenze otáčí určitou rychlostí nebo otáčkami za minutu (RPM), odstředivá síla způsobí, že se částice posunou radiálně pryč od osy rotace. Síla působící na částice (ve srovnání s gravitací) se nazývá Relative Centrifugal Force (RCF). Například RCF 500 x g znamená, že použitá odstředivá síla je 500krát větší než gravitační síla Země. Tabulka 1 ilustruje běžné třídy odstředivek a jejich aplikace.

Tabulka 1. Třídy odstředivek a jejich použití

Tabulka se posouvá vodorovně

Třídy odstředivek
Nízká rychlost Vysoká rychlost Ultra/mikro-ultra
Maximální rychlost (ot./min x10 3 ) 10 28 100/150
Maximální RCF (x10 3 ) 7 100 800/900
Peletovací aplikace
Bakterie
Ano Ano (Ano)
Živočišné a rostlinné buňky Ano Ano (Ano)
Nuclei Ano Ano (Ano)
Sraženiny Nějaký Většina (Ano)
Membránové frakce Nějaký Nějaký Ano
Ribozomy/polysomy - - Ano
Makromolekuly - - Ano
Viry - Většina Ano
Viry - Většina Ano

() = lze provést, ale obvykle se k tomuto účelu nepoužívá.


Základy centrifugace

Centrifugace je technika, která pomáhá oddělovat směsi aplikací odstředivé síly. Odstředivka je zařízení, obecně poháněné elektrickým motorem, které uvádí předmět, např. rotor, do rotačního pohybu kolem pevné osy.

Odstředivka pracuje na principu sedimentace: Pod vlivem gravitační síly (g-síla) se látky oddělují podle své hustoty. Jsou známy různé typy separace, včetně isopyknické, ultrafiltrace, hustotního gradientu, separace fází a peletizace.

Peletování je nejběžnější aplikací pro odstředivky. Zde se částice koncentrují jako peleta na dně centrifugační zkumavky a oddělují se od zbývajícího roztoku, nazývaného supernatant. Během separace fází se chemikálie převádějí z matrice nebo vodného média na rozpouštědlo (pro další chemickou nebo molekulárně biologickou analýzu). Při ultrafiltraci se makromolekuly čistí, separují a koncentrují pomocí membrány. Izopyknická centrifugace se provádí za použití "samogenerujícího" hustotního gradientu vytvořeného pomocí rovnovážné sedimentace. Tato metoda koncentruje shody analýzy se shodami okolního řešení. Protokoly pro centrifugaci typicky specifikují relativní odstředivou sílu (rcf) a stupeň zrychlení v násobcích g (g-force). Práce s rychlostí otáčení, jako jsou otáčky za minutu (ot/min), je značně nepřesná.

Důležité definice

Obecně platí, že aplikace pro odstřeďování specifikují stupeň zrychlení, který má být aplikován na vzorek, spíše než specifikaci konkrétní rychlosti otáčení, jako jsou otáčky za minutu. Zrychlení se obvykle udává v gravitaci [× g] (nebo násobcích x g nebo g-síla), což je standardní hodnota zrychlení způsobená gravitací na zemském povrchu (9,81 m/s 2 ). Rozlišení mezi otáčkami za minutu a rcf je důležité, protože dva rotory s různými průměry běžící při stejné rychlosti otáčení (rpm) budou mít za následek různá zrychlení (rcf).

Protože pohyb rotoru je kruhový, zrychlovací síla se vypočítá jako součin poloměru a druhé mocniny úhlové rychlosti. Historicky známá jako „relativní odstředivá síla“ (rcf) je měřením zrychlení aplikovaného na vzorek v rámci kruhového pohybu. Tento proces se měří v jednotkách gravitace
(× g).

Příklad*

Rotor A Rotor B
Rychlost 14 000 ot./min 14 000 ot./min
Poloměr 5,98 cm9,50 cm
Gravitace 13 100 × g20 817 × g

Jak bylo zmíněno, při použití
rotory s různými poloměry pro odstřeďování, stejný rcf
(g-force).

Obě centrifugy mohou otáčet rotorem se zkumavkami o objemu 1,5/2 ml stejnou rychlostí (14 000 ot./min.), ale zrychlení aplikované na vzorky je velmi odlišné: 13 100 × g versus 20 817 × g, což vede k odlišným výsledkům. Pro usnadnění života a lepší reprodukci dat mají některé odstředivky přímo na ovládacím panelu tlačítka pro automatický převod mezi otáčkami za minutu a rcf. Pokud vaše odstředivka nemá převodník rpm-rcf, můžete pro převod použít vzorec, převodník rpm-rcf, který najdete na domovských stránkách dodavatelů odstředivek, nebo nomogram. K-faktor je parametr pro sedimentační vzdálenost ve zkumavce. Tento faktor se také nazývá clearing factor a představuje relativní peletizační účinnost centrifugačního systému při maximální rotační rychlosti. Obecně se hodnota k-faktoru používá k odhadu času t (v hodinách), potřebného pro úplnou sedimentaci frakce vzorku se známým sedimentačním koeficientem měřeným v s (svedberg).

Malý k-faktor představuje rychlejší separaci. Hodnota k-faktoru je primárně určena průměrem rotoru. Ve srovnání s rpm/rcf se použití k-faktoru stalo méně důležitým pro obecné centrifugační procesy. Zejména pro ultracentrifugaci je k-faktor stále relevantní.

Jak vybrat správnou centrifugu pro vaši aplikaci

Pokud postupujete podle daného protokolu, ujistěte se, že používáte stejný typ rotoru a aplikujte danou relativní odstředivou sílu (rcf), stejně jako stejnou teplotu a dobu chodu. Pro úspěšnou centrifugaci je obecně nutné stanovit následující hlavní parametry:

E: Stanovení požadované relativní odstředivé síly

F: Definovaná teplota během centrifugace

Rotory s pevným úhlem nebo otočné lopatky

Nejběžnější rotory v laboratorní centrifugaci jsou buď rotory s pevným úhlem nebo rotory s výkyvnými lopatkami. Pouze několik aplikací vyžaduje speciální rotory, jako jsou kontinuální rotory, bubnové rotory a podobně. Průtokové rotory umožňují kontinuální průtokový sběr precipitátů. Tyto systémy se používají např. ve sběrných fermentorech nebo pro výrobu šťávy v potravinářském průmyslu. Jsou nutné speciální přizpůsobené verze, optimalizované pro konkrétní aplikaci.

Rotor s pevným úhlem

Zjevnou výhodou je absence pohyblivých částí v rotoru. To má za následek nižší namáhání kovu (delší životnost), je možná vyšší maximální g-síla a pro mnoho aplikací lze realizovat rychlejší doby odstřeďování. Omezená kapacita (menší flexibilita) rotoru s pevným úhlem je jedinou nevýhodou. Poloha pelety silně závisí na úhlu trubice, je umístěna ze strany ke dnu trubice při rotaci. Většina rotorů má pro trubky úhel 45°. Čím větší je úhel pro trubky, tím těsnější je peleta. Menší úhly rotoru mají za následek více rozprostřených ploch pelet.

Rotor s kyvnou lopatou

Tento druh rotoru je vysoce flexibilní pro použití různých formátů zkumavek, včetně desek formátu SBS, založených na široké řadě systémů adaptérů a vysoké kapacitě vzorků. Pohyblivé části otočné lopaty mají za následek zvýšené namáhání kovu pro rotor a lopaty, protože hmotnost lopaty zatěžuje dva čepy a drážky. Ve srovnání s rotorem s pevným úhlem je proto otočný rotor omezen na nižší maximální g-sílu, což vede k delší době odstřeďování. Na principu swing-bucket je peleta umístěna na dně trubky (horizontální poloha trubky během chodu). Regenerace uživatelem je usnadněna ve srovnání s peletami umístěnými na straně zkumavky.


Metody použité pro separaci částic při centrifugaci: 3 metody

Tento článek vrhá světlo na tři metody používané pro separaci částic při centrifugaci.

Tyto tři metody jsou: (1) Diferenciální centrifugace (2) Centrifugální elutriace a (3) Centrifugace s gradientem hustoty. Metoda centrifugace s gradientem hustoty se skládá ze dvou technik. Tyto dvě techniky jsou: (1) technika zónové rychlosti a (2) technika izopyknické centrifugace.

Metoda č. 1. Diferenciální centrifugace:

To závisí na rychlosti sedimentace částic různé velikosti a hustoty. Centrifugace zpočátku sedimentují největší částice.

U částic se stejnou hmotností, ale s různou hustotou, bude sedimentovat jako první ta s nejvyšší hustotou. Částice s podobnou hustotou pásů mohou být obvykle účinně odděleny jedna od druhé pomocí diferenciální centrifugace nebo rychlostní zónové metody za předpokladu, že existují alespoň 10násobné rozdíly v jejich hmotnostech.

Při diferenciální centrifugaci se materiál, který má být separován, dělí odstředivě na počet frakcí zvýšením použitého odstředivého pole. Odstředivé pole v každém kroku je voleno tak, aby sedimentoval konkrétní typ materiálu. Jakýkoli typ částic původně přítomných v homogenátu lze nalézt v peletě nebo v supernatantu nebo v obou frakcích, v závislosti na době a rychlosti centrifugace a velikosti a hustotě částic. Na konci každého stupně se peleta a supernatant oddělí a peleta se několikrát promyje resuspendováním a opětovným odstředěním v homogenizačním médiu.

Nejprve jsou všechny částice homogenátu homogenně distribuovány v centrifugační zkumavce. Během odstřeďování se částice pohybují dolů v odstředivkových zkumavkách při příslušných sedimentačních rychlostech a začnou tvořit peletu na dně odstředivkové zkumavky. V ideálním případě odstřeďování pokračuje natolik, aby se peletovaly všechny největší třídy částic, výsledný supernatant se pak odstřeďuje při vyšší rychlosti, aby se oddělily středně velké částice a tak dále.

Protože však částice různých velikostí a hustot byly na začátku centrifugace rozděleny homogenně, je zřejmé, že peleta nebude homogenní, ale bude obsahovat směs všech sedimentovaných složek, která bude obohacena o nejrychleji sedimentující částice. V době potřebné pro úplnou sedimentaci těžších částic se usadí i některé lehčí a středně velké částice, původně suspendované u dna zkumavky, a tím kontaminují frakci.

Čistou přípravu pelety nejtěžší částice proto nelze získat v jediném kroku odstřeďování. Je to pouze nejpomaleji sedimentující složka směsi, která zůstala v supernatantu poté, co byly sedimentovány všechny větší částice, kterou lze čistit jediným krokem centrifugace.

Separace dosažená diferenciální centrifugací může být zlepšena opakovaným resuspendováním a recentrifugací za podobných podmínek. Další odstřeďování supernatantu s postupně se zvyšujícími odstředivými poli vede k sedimentaci středních a nakonec nejmenších a nejméně hustých částic. Navzdory svým přirozeným omezením je diferenciální centrifugace pravděpodobně nejběžněji používanou metodou pro izolaci buněčných organel z homogenizované tkáně.

Metoda č. 2. Odstředivá elutriace:

V této technice lze separaci a čištění velkého množství buněk z různých tkání a druhů dosáhnout jemným promýváním pomocí rotoru elutriátoru. Technika je založena na rozdílech v nastavení v separační komoře rotoru, mezi protilehlým dostředivým prouděním kapaliny a aplikovaným odstředivým polem používaným k separaci částic především na základě rozdílů v jejich velikosti.

Technika nepoužívá gradient hustoty a má výhodu, že lze použít jakékoli médium zcela kompatibilní s částicemi. Touto separací lze dosáhnout velmi rychle, poskytující vysoké koncentrace buněk a velmi dobrý výtěžek regenerace.

Metoda č. 3. Centrifugace s gradientem hustoty:

Existují dvě metody odstřeďování s hustotním gradientem, technika rychlostní zónové a izopyknická (izohustotní nebo stejná hustota) technika a obě lze použít, když je vyžadována kvantitativní separace všech složek směsi částic. Používají se také pro stanovení vztlakových hustot a pro odhad sedimentačního koeficientu.

(a) Hodnotit zónovou techniku:

Separace částic technikou rychlostní zóny je založena na rozdílech ve velikosti, tvaru a hustotě částic, hustotě a viskozitě média a použitém odstředivém poli. Subcelulární organely, které mají různé hustoty, ale jsou podobné velikosti, se pomocí této metody neoddělují účinně, ale lze snadno dosáhnout separace proteinů podobných hustot a lišících se pouze 3 krát v relativní molekulové hmotnosti.

Tato technika zahrnuje pečlivé navrstvení roztoku vzorku na předem vytvořený gradient hustoty kapaliny, jehož nejvyšší hustota nepřesahuje hustotu nejhustší částice, která má být separována. Funkcí gradientu je primárně stabilizovat sloupec kapaliny v trubici proti pohybům vyplývajícím z konvenčních proudů a sekundárně vytvořit gradient, který pomáhá zlepšit rozlišení gradientu.

Vzorek se poté odstřeďuje, dokud se nedosáhne požadovaného stupně separace. Vzhledem k tomu, že tato technika je časově závislá, musí být centrifugace ukončena před jakoukoli z pelet separované zóny na dně zkumavky. Technika se používá pro separaci enzymů, hybridů RNA-DNA, ribozomálních podjednotek, subcelulárních organel atd.

(b) Technika izopyknické centrifugace:

Izopyknické odstřeďování závisí výhradně na výkupní hustotě a nikoli na jejím tvaru, velikosti a čase, přičemž velikost částice ovlivňuje pouze rychlost, kterou dosáhne své izopyknické polohy v gradientu. Tato technika se používá k separaci částic podobné velikosti, ale různé hustoty. Proto rozpustné proteiny, které mají velmi podobné hustoty, nemohou být obvykle separovány touto metodou, kde mohou být účinně separovány subcelulární organely.

Tyto metody jsou kombinací sedimentace a flotace a zahrnují vrstvení vzorku na vrchol hustotního gradientu, který pokrývá celý rozsah hustot částic, které mají být separovány. Maximální hustota gradientu proto musí vždy převyšovat hustotu nejhustší částice. Během odstřeďování dochází k sedimentaci částice, dokud se hustota částice a hustota gradientu nerovnají.

V tomto bodě izodenzity nedochází k žádné další sedimentaci, bez ohledu na to, jak dlouho odstřeďování pokračuje, protože částice plavou na polštáři materiálu, který má hustotu větší než jejich vlastní. Izopyknická centrifugace, na rozdíl od techniky rychlostní zóny, je rovnovážná metoda, páskování částic za účelem vytvoření zón, z nichž každá má svou vlastní charakteristickou vztlakovou hustotu.

V případě, kdy nejsou požadovány všechny složky ve směsi částic, lze zvolit gradientní rozsah, ve kterém budou nežádoucí materiály sedimentovat na dně zkumavky a celé částice, které jsou předmětem zájmu, budou plavat ve svých příslušných izopynických polohách. Taková technika zahrnuje kombinaci zónového a izopynického přístupu.

Vlastnosti materiálu Gradient:

Neexistuje žádný ideální univerzální gradientový materiál, výběr rozpuštěné látky závisí na povaze částic, které mají být frakcionovány.

Gradientový materiál by měl:

i. Povolte toužebný typ odloučení

iii. Buďte inertní vůči biologickému materiálu a nereagujte s centrifugou, rotorem, zkumavkami nebo uzávěry:

iv. Neabsorbuje světlo na vlnových délkách vhodných pro spektrofotometrické monitorování (viditelný nebo ultrafialový rozsah) ani jinak neinterferuje s testovacími postupy

v. Být sterilizovatelné, netoxické nebo hořlavé

vi. Mají zanedbatelný osmotický tlak a způsobují minimální změny iontové síly, pH a viskozity

vii. Být levný a snadno dostupný v čisté formě a schopný vytvořit řešení pokrývající rozsah hustoty potřebný pro konkrétní aplikaci, aniž by došlo k nadměrnému namáhání rotoru

viii. Umožňují snadnou separaci materiálu vzorku od gradientového média se ztrátou vzorku nebo jeho aktivity.

Obecně používanými gradientovými materiály jsou soli alkalických kovů (např. cesium a chlorid rubidium), malé neutrální hydrofilní organické molekuly (např. sacharóza), hydrofilní makromolekuly (např. proteiny a polysacharidy) a řada různých sloučenin, jako je koloidní oxid křemičitý (např. např. percoll a ludox) a neiontové jodované aromatické sloučeniny (např. metrizamid, nycodenz a renograffin).

Bylo zjištěno, že roztok sacharózy, který trpí nevýhodami, že je velmi viskózní při hustotách vyšších než 1,1 až 1,2 g cm-3 a vykazuje velmi vysoké osmotické účinky i při velmi nízkých koncentracích, je nejvhodnější gradientový materiál pro rychlostní zónovou separaci. Glycerol se také používá jako gradientový materiál, zejména pro separaci enzymů, nebo lze použít alternativní média, jako jsou gradienty ficoll, metrizamid nebo percoll.

Neiontová média, jako je sacharóza, glycerol, metrizamid, ficoll a percoll, jsou obecně považována za genderově odlišná než iontové soli, jako je chlorid česný a bromid draselný a vyžadují nižší odstředivá pole, aby bylo dosaženo adekvátní separace částic. V případě izopyknické separace se žádné médium neprokázalo jako uspokojivé pro izolaci všech typů biologických částic.

Ficoll se úspěšně používá pro separaci celobuněčných a subcelulárních organel rychlostní zonální a izopyknickou centrifugací. Cesiové a rubidiové soli se používají výhradně pro isopyknické separace a nejčastěji se používají pro separaci rozpuštěných látek s vysokou hustotou, jako jsou nukleové kyseliny.

Avšak při vysokých koncentracích má jejich vysoká iontová síla a osmolarita tendenci narušovat intra- a intermolekulární vazby. Obecně byla iontová média používána pro separaci nukleových kyselin, proteinů a virů a neiontové jodované aromatické sloučeniny, kvůli jejich zvýšené všestrannosti, byly použity pro mnohem širší škálu aplikací.


Jak funguje umírání

Poté, co srdce přestane bít, tělo okamžitě začne chladnout. Tato fáze je známá jako algor mortis, nebo smrtelný chlad. Každou hodinu tělesná teplota klesne asi o 1,5 stupně Fahrenheita (0,83 stupně Celsia), dokud nedosáhne pokojové teploty. Ve stejnou dobu, bez cirkulace, která by ji udržovala v pohybu tělem, se krev začne shromažďovat a usazovat. Posmrtné ztuhnutí, neboli ztuhnutí těla, nastává asi dvě až šest hodin po smrti [zdroj: Marchant, Middleton].

Zatímco tělo jako celek může být mrtvé, malé věci v těle jsou stále živé. Například kožní buňky mohou být životaschopně sklízeny až 24 hodin po smrti [zdroj: Mims]. Ale některé věci, které jsou stále živé, vedou k hnilobanebo rozklad těla -- mluvíme o malých organismech, které žijí ve střevech.

Několik dní po smrti tyto bakterie a enzymy zahájí proces rozkladu svého hostitele. Slinivka je plná tolika bakterií, že se v podstatě sama tráví [zdroj: Macnair]. Jak se tyto organismy propracovávají k jiným orgánům, tělo se zbarvuje, nejprve zezelená, poté zfialoví a poté zčerná. Pokud změnu nevidíte, brzy ji ucítíte, protože bakterie vytvářejí příšerně páchnoucí plyn. Kromě toho, že tento plyn provoní místnost, způsobí nadýmání těla, vylézání očí z důlků a opuchnutí a vystrčení jazyka. (Ve vzácných případech tento plyn po několika týdnech vytvořil dostatečný tlak, aby způsobil rozkládajícím se těhotným ženám vypuzení plodu v procesu známém jako narození rakve.)

Týden po smrti má kůže puchýře a sebemenší dotyk by mohl způsobit její odpadnutí. Měsíc po smrti vypadnou vlasy, nehty a zuby. Mimochodem, vlasy a nehty, i když se dlouho říkalo, že po smrti rostou, nemají žádné magické růstové vlastnosti. Pouze vypadají větší, když kůže vysychá. Vnitřní orgány a tkáně zkapalněly, což bude otékat tělo, až se roztrhne. V tu chvíli zůstane kostra.

Nyní většina z nás tento proces nevidí, protože zákon vyžaduje, abychom s tělem něco udělali. Možností je nekonečně: Můžeme si vybrat rakev pro své tělo nebo urnu pro svůj popel. Můžeme se nechat nabalzamovat, mumifikovat nebo zmrazit. O některých kulturách se říkalo, že se zapojily do kanibalských rituálů konzumace mrtvých, zatímco jiné nechávaly své mrtvé vystavené živlům, aby je zvířata mohla odvézt. Můžete darovat své tělo vědě nebo požádat o pohřeb na moři. Ale pokud nejsou mumifikována nebo konzervována, těla se nakonec rozpadají v procesu popsaném výše. Pohřeb v rakvi však tento proces nesmírně zpomaluje, dokonce i typ půdy, ve které jste pohřbeni, může změnit.

Likvidace mrtvého těla je do značné míry regulována kulturním a náboženským přesvědčením. Rané kultury pohřbívaly mrtvé s jejich oblíbeným majetkem (a někdy i se svými oblíbenými lidmi) pro posmrtný život. Někdy byli válečníci nebo sluhové pohřbeni ve stoje, věčně připraveni k akci. Ortodoxní Židé zahalují své mrtvé a pohřbívají je ve stejný den jako smrt, zatímco buddhisté věří, že vědomí zůstává v těle tři dny [zdroj: Mims]. Hinduisté jsou zpopelňováni, protože se věří, že spálení uvolňuje duši z těla, zatímco římští katolíci se mračí na kremaci z úcty k tělu jako symbolu lidského života [zdroje: Mims Cassell et al].

Náboženství a kultura se budou vždy prolínat se smrtí a jedna velká oblast vlivu se týká etických otázek kolem procesu umírání. Na další stránce se budeme zabývat některými problémy.


Praktická práce pro učení

Třída praktická

V raných studiích biologie se často zaměřujeme na trávicí enzymy. To může studenty vést k tomu, že si budou myslet, že enzymy fungují pouze na rozbití chemikálií. Tato enzymaticky katalyzovaná syntéza nabízí alternativní enzymatickou reakci vedoucí k vytvoření nové molekuly.

The aim of the investigation is to prepare an extract of potato tuber, remove starch from it, and then check for its ability to catalyse the synthesis of starch from different substrates.

Organizace lekce

The enzyme extraction takes about half an hour. The extract can be stored overnight at 4 °C, but it will turn brown. To complete the investigation in one session, prepare the substrate solutions and set up the colorimeter while making the enzyme extract. Different groups could be responsible for different parts of the experiment.

Přístroje a chemikálie

Pro každou skupinu studentů:

Access to a water bath at 25 °C

Centrifuge, 3000 rpm/ RCF 1000 g (Poznámka 3)

2 medium-sized potatoes (Poznámka 4)

Pro třídu – sestavenou technikem/učitelem:

50 cm 3 of 1% glucose-1-phosphate, for up to 8 groups (Poznámka 1)

50 cm 3 of 1% glucose, for up to 8 groups

50 cm 3 of 1% maltose, for up to 8 groups

50 cm 3 of 1% sucrose, for up to 8 groups

Iodine solution (Poznámka 2)

Zdraví a bezpečnost a technické poznámky

1 Glucose-1-phosphate: Make up the solution by dissolving 0.5 g of glucose-1-phosphate in 50 cm 3 of distilled water (a 1% solution). The compound is unstable in solution, hydrolysing quite rapidly to glucose and phosphoric acid at room temperature. Prepare just before use, or store in a refrigerator (at 4 °C) for up to 24 hours. This, and the other sugar solutions, are described on the CLEAPSS Hazcard as LOW HAZARD.

2 Iodine solution: Iodine is only sparingly soluble in water (0.3 g per litre). It is usual to dissolve iodine in potassium iodide solution (KI) to make a 0.01 M solution (by tenfold dilution of a 0.1 M solution) to use as a starch test reagent. Refer to CLEAPSS Recipe card 33. For 100 cm 3 of 0.1 M solution, measure 3.0 g of potassium iodide (KI) into an appropriate beaker. Moisten the potassium iodide with a few drops of water. Measure out 2.54 g of iodine (see Hazcard 54: iodine is harmful) and add to the moistened potassium iodide. Add a small volume of water and stir. When no more iodine appears to dissolve, add some more water and stir. Repeat until all the iodine has dissolved. Pour the solution into a measuring cylinder and dilute to the final volume. If there are any bits of iodine remaining, return the solution to the beaker and leave it on a magnetic stirrer for several minutes. Add the solution to a labelled bottle and mix well.

3 Centrifuge: You need enough ‘centrifuge space’ to produce around 25 cm 3 of potato extract for each working group. A speed of just under 3000 revolutions per minute, corresponding to a relative centrifugal force (RCF, ‘g-force’) of just under 1000 g is enough to spin down starch grains.

SAFETY: The CLEAPSS Laboratory Handbook gives detailed information about the requirements of the British and International Standard (BS EN 61010-2-020) for centrifuges. Use this information to assess your school’s centrifuges if your documentation does not clearly state that they conform to this standard. The DfEE has stated that: ”Existing centrifuges not conforming to the safety requirements of this standard should not be used after 1 January 1997.” (Z Safety in Science Education, HMSO, 1996, ISBN 011270915X). CLEAPSS advise that centrifuges which do not cut off the power to the rotor when the lid is raised, or have an exposed rotor, should be taken out of service. If using any centrifuge without a lock, users should not raise the lid until they can slyšet that the rotor has stopped.

4 Potatoes: Medium-sized potatoes are best. Large potatoes often have a poor yield of phosphorylase enzyme. Small new potatoes have such small grains of starch that they are difficult (or impossible) to spin down.

Postup

SAFETY: Ensure your centrifuge is safe to use and that students are briefed to use it correctly. Make eye protection available when iodine solution is dispensed.

Příprava

A Make up a 1% solution of glucose-1-phosphate in distilled water (Poznámka 1).

b Make up iodine solution (Poznámka 2).

C Prepare the colorimeter by putting a known volume of water (say 3 cm 3 ) into your colorimeter cuvettes or bottle. Add 0.5 cm 3 or 1 cm 3 of iodine solution (Poznámka 2) and swirl to mix well. Make sure this liquid is deep enough in the vessel to provide an accurate reading in your colorimeter (by comparing with a full colorimeter vessel of the same solution). Use a yellow filter, as we will be following the formation of a blue starch-iodide complex (peak of absorption 580-600 nm). Record the reading from the iodine solution as the ‘zero’ reading for this procedure. Set up ‘clean’ cuvettes to follow the reaction with 2 cm 3 of water and 0.5 or 1.0 cm 3 of iodine solution. You will add 1.0 cm 3 of starchy solution to each of these.

Vyšetřování

d Take two medium-sized potatoes, peel and cut into small pieces (Poznámka 4). Crush with a pestle and mortar or use a blender. Add water sparingly so that the resulting mash is just liquid enough to be poured from the container.

E Pour the crushed potato quickly through a single layer of muslin or nylon stocking.

F Transfer the extract to centrifuge tubes. Spin in a bench centrifuge for 5 minutes at the highest speed to separate the starch granules (Poznámka 3).

G After spinning, take one drop of clear liquid from the top of each tube. Test each drop on a white tile with iodine solution. If the blue colour characteristic of starch appears, centrifuge for a further 5 minutes.

h Repeat the iodine test and, if necessary, continue to centrifuge until no starch is detectable in the samples of clear liquid. Once the liquid is free of starch, carefully pour the clear liquid from each centrifuge tube into a single container. If this is to be kept overnight, stopper and refrigerate the container.

i Label 4 test tubes. Use a syringe to put 5 cm 3 of glucose-1-phosphate into a test tube. Place it in a water-bath at 25 °C. Use fresh syringes to measure 5 cm 3 of the other substrates into the other test tubes in the same water-bath. Record which substrate is in which tube.

j Use a syringe to measure four 5 cm 3 samples of the clear potato extract into each of four more test tubes, and place in the water bath at 25 °C.

k Add 5 cm 3 of potato extract from a tube in the water bath to each tube of substrate solution. Start the stopclock.

l After two minutes, take a single drop of the potato extract/ glucose-1-phosphate mixture. Mix it with a drop of iodine in one of the wells of a spotting tile. Look for a very slight colour change. If there is none, repeat at 2-minute intervals as recorded by the stopclock.

m As soon as the slightest trace of blue or grey colour appears on the tile, remove 1.0 cm 3 from the mixture into your colorimeter vessel containing 2 cm 3 of water and 0.5 cm 3 or 1.0 cm 3 of iodine solution. Dobře promíchejte. Record the colorimeter reading and the time.

n Using fresh iodine solution, carry out similar measurements with the other three extract/ substrate mixtures.

Ó Check the amount of enzyme extract/ substrate mixture left. Arrange to take more samples at regular intervals. Try to take at least 8 readings for each extract/ substrate mix. If colorimeter readings are changing rapidly from one sample to the next with a particular substrate, concentrate on that mixture and take samples as often as possible. Then return to the other extract/ substrate mixtures.

p For each measurement, record the substrate, time, apparent colour (to your eye) and colorimeter reading.

q Convert the meter readings into starch concentrations using a calibration curve. (See associated practical on this site.)

Výukové poznámky

After dealing with the digestion of starch, it is appropriate to ask how starch is formed in the first place. The tissue of potato tubes is a good source of the enzyme(s) responsible for the synthesis of starch.

Digestion of starch yields first maltose and then glucose, so synthesis could be a simple reversal of this process. Alternatively, the best substrate could be one of the compounds inside cells which is closely related to simple sugars an example is glucose-1-phosphate. This demonstration shows that an anabolic pathway need not be the simple reversal of the catabolic pathway. The hydrolysis of the glucose-1-phosphate provides the energy necessary to synthesise the starch.

The starch in potato tubers is stored inside cells in large granules which sediment on centrifugation. If you examine a drop of the glucose-1-phosphate/ enzyme mixture under a microscope at the end of the investigation, you may see starch granules 4 to 10 ?m in diameter.

The ‘lag phase’ at the beginning of the process suggests that the reaction is autocatalytic. CS Hanes (1940) demonstrated this by including small amounts of soluble starch to the reaction mixture this reduced the length of the lag phase. Your students are unlikely to come up with the idea of autocatalysis on their own however it is worth discussing as an example of the way in which graphs can be used to suggest and develop hypotheses.

Health & Safety checked, May 2009

Stahování

Download the student sheet Enzyme-catalysed synthesis (73 KB) with questions and answers.


Part 3: How do you choose a centrifuge?

Centrifuge speed

Centrifuges may be classified based on maximum speeds, measured as revolutions per minute (RPM). Speeds range from 0-7,500 RPM for low-speed centrifuges, all the way to 20,000 RPM or higher.

Centrifuge rotor speed is often expressed as RCF in units of gravity (x G) for various procedures. However, many centrifuges display speed as revolutions per minute (RPM), necessitating conversion to ensure the correct experimental conditions. The following formula is used to convert RPM to RCF, where R is the rotor radius (cm) and S is the speed (RPM):

Centrifuge size

Centrifuges are available as various benchtop or floor-standing models.

Floor-standing models offer greater sample capacity and can achieve high speeds. Superspeed centrifuges can achieve a maximum G-force (relative centrifugal force, RCF) of over 70,000 x G, and ultracentrifuges often used for DNA or RNA fractionation, can achieve up to 1,000,000 x G. For large-capacity, low-speed applications, low-speed centrifuges reaching approximately 7000 x G jsou dostupné.

Benchtop models have a smaller footprint, and general-purpose models are ideal for a wide range of applications. There are many benchtop models available, including high-speed, microcentrifuge, clinical, and cell washer models. Clinical benchtop models and cell washers typically operate at lower speeds, and are suited to diagnostic applications, and washing debris from red blood cells.

Centrifuges for different applications

It is essential to select a centrifuge that is suited to the specific application. When purchasing a centrifuge, it is important to consider the following questions:

  • What sample volumes are you working with? For processes involving large or varying volumes, a floor-standing model with higher capacity and different rotor configurations may be the best solution.
  • Are samples temperature sensitive? If so, a centrifuge with refrigeration and temperature control options is required.
  • Will the centrifuge be used for processing clinical or blood banking samples? Cell washers or clinical models are available for these specific applications.
  • How much laboratory space is available vs the centrifuge footprint?
  • What is the maximum g-force the centrifuge is capable of generating? Low-speed centrifuges are ideal for separating whole cells, while ultracentrifuges are necessary for separating DNA and RNA.

Centrifugation speeds for cells. - (Feb/05/2013 )

What speed do you guys use to spin down your cells? Is there a rule of thumb for the different types of cells in terms of centrifugation speed?

I am having a problem with my cell count and I am not sure if the spinning down process is shearing my cells. Last night I counted my cell suspension with a hemocytometer and it came out to 1.5*10^6 cells but the FACS analysis reported a much lower number (around 10^4 cells). I know I will lose cells during the staining process and during the analysis but going from 10^6 to 10^4 is huge loss. Any advice will be appreciated.

Hm, I spin my cells down with 1300rpm for 3 min. Later during the FACS staining process I spin them down with 2400 rpm for 3 min, but be careful as this can harm the cells. Interestingly I also observe huge cell loss during the staining process although I never quantified it like you did. Do some of your cell stick to the wall of the reaction tube perhaps ?

Tabaluga on Tue Feb 5 19:12:56 2013 said:

Working with epithelia cells I use 3000 rpm for 3mins and working with HSCs the protocol calls for 1500 rpm for 5mins. I don't think my cells are sticking to the wall of the reaction tube but I don't know for sure. I don't know if it is pipetting error, cell count error or the speed of spinning.

For spinning live cells do not exceed 300 RCF (relative centrifugal forces also known as "g"), it is best to do it as low as possible, I routinely use 100 RCF for 5-10 min and it works fine for all the cancer cell lines that I work with.

When working with centrifuges, rpm is a relative measure that has no reference unless you also provide the rotor radius so Wek's 3000 rpm may in fact be lower RCF than Tabaluga's 2400, but we will never know.

Spinning too fast can cause a "smear" of cells up the wall of the tube that you may be missing when resuspending the cells.

Just looked it up, my 2400 rpm correspond to 600 g, apparently.

I will try 100, 200, and 300 RCF for 5 mins and see if there is any significant loss of cells. My 3000 rpm equals to 800 RCF.
I have actually noticed the line smear on the wall of the tube when using compensation beads but haven't really noticed it when spinning down cells.

Dear Guys,
I know this is out of ur discussion, but regarding converting RPM into G or vice verse, I just measure the radius of my centrifugal ring, not the whole machine, just the rotor radius with a ruler or something, put the data on RPM-G converter like these website:
http://www.endmemo.com/bio/grpm.php
http://www.geneinfinity.org/sp/sp_rotor.html

then I got the required number in G or in RPM

great links, thanks. Some centrifuges have also got the advantage that you can switch between both values on the display, thereby detemining very quickly the relation between their rpm and g.

Just to throw in my 2 cents. In a neuro lab we spin at 90g for glia, and 160g for neurons in 15ml falcon tubes for 3 minutes.

Considering neurons are pretty small I doubt you'd need to go much faster.


Podívejte se na video: DŘEVNÍ ODROL PELETOVACÍ LIS BN 100, VÝROBA DŘEVNÍCH PELET PRO domací TOPENÍ AUSTRIA (Červenec 2022).


Komentáře:

  1. Fera

    Velmi zvědavá otázka

  2. Bayen

    Je to výborný nápad. Je připravena vás podpořit.

  3. Pedro

    přesně k věci :)

  4. Lindleigh

    Je škoda, že teď nemohu mluvit - není žádný volný čas. Vrátím se - určitě vyjádřím svůj názor na tento problém.



Napište zprávu