Informace

Proč jsou některé geny pro domácnost považovány za lepší?

Proč jsou některé geny pro domácnost považovány za lepší?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kdykoli se provádí PCR, musíme použít provozní geny, jako je GAPDH, abychom sami normalizovali hodnoty, aby odpovídaly různým výchozím cDNA/DNA. Nyní existuje mnoho různých genů, jako je GAPDH, ubiquitin, aktin atd.

Nyní, když se zabývám buňkami, chápu, že kvůli jejich nesmrtelné povaze a upřímně šokujícímu počtu generací, které tyto buňky prošly, se může exprese housekeeping genu změnit.

Za předpokladu, že nemám co do činění s buňkami a místo toho se zvířecími tkáněmi, záleží na tom, který housekeeping gen vyberu? Nebo jinými slovy, GAPDH mi poskytne stejnou konzistenci mezi vzorky jako něco jako 18s Ribsomal RNA, nebo mi něco konkrétního chybí?


Ano, záleží. Genová exprese se v tkáních a životních podmínkách velmi liší, takže musíte otestovat různé geny a vybrat ty s nejmenší odchylkou v expresi mezi vzorkem a kontrolou.

Pokud žádné nenajdete, musíte za tímto účelem otestovat jiné geny. Tento je důležité, protože to může vážně ovlivnit výsledek vašeho experimentu, protože se normalizujete na geny pro úklid. Pokud tyto nejsou konstantní, způsobí to problémy. Podívejte se do referencí, moc mi to pomohlo.

Reference:

  1. Přesná normalizace kvantitativních dat RT-PCR v reálném čase geometrickým průměrováním více genů vnitřní kontroly.
  2. Normalizace dat genové exprese u melanomu: zkoumání použití glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy a 18S ribozomální RNA jako interních referenčních genů pro kvantitativní PCR v reálném čase.
  3. Normalizace dat qRT-PCR: nutnost přijmout systematickou validaci referencí specifickou pro experimentální podmínky.

Musíte si však dávat pozor. Některé velmi používané geny mohou být velmi neinformativní jako provozní geny v qPCR. ACTB a GAPDH mají tuny pseudogenů (analogické geny neposkytující proteiny), které mohou interferovat s PCR. Více si můžete přečíst v tomto článku (1).

Aby to bylo ještě horší, amplifikační fragmenty PCR mohou mít přesně stejnou délku jako amplikon ACTB, což znemožňuje jejich odlišení.

Kromě toho musíte vzít v úvahu specifický typ buňky/aplikaci/léčbu, protože některé mRNA mohou být velmi konstantní při léčbě A na buňce typu 1, ale liší se při léčbě B nebo na buňce typu 2.

Myslím, že nejlepší by bylo použít vícenásobný úklid (3-5) a zjistit, jak se chovají vůči sobě navzájem. Můžete také použít prostředky tohoto úklidu.

(1) Sun, Yuan a kol. "Pseudogeny jako slabiny ACTB (Actb) a GAPDH (Gapdh) používané jako referenční geny při reverzní transkripci a polymerázových řetězových reakcích." PloS one 7.8 (2012): e41659.


Identifikace lidských domácích genů a tkáňově selektivních genů pomocí mikroarray metaanalýzy

Zařazení proteinů kódujících transkriptomy normálních tkání do provozních genů a tkáňově selektivních genů je základním krokem ke studiu genetických funkcí a genetických asociací s tkáňově specifickými onemocněními. Předchozí studie byly založeny hlavně na několika souborech dat s omezenými vzorky v každé tkáni, což omezovalo reprezentativnost jejich identifikovaných genů a vedlo k nízké shodě mezi nimi.

Výsledek

Tato studie shromáždila 1 431 vzorků ve 43 normálních lidských tkáních ze 104 datových souborů microarray. Vyvinuli jsme novou metodu pro zlepšení hodnocení genové exprese a ukázali jsme, že k robustní identifikaci transkriptomu tkáně kódujícího protein je potřeba více než deset vzorků. Identifikovali jsme 2 064 provozních genů a 2 293 tkáňově selektivních genů a analyzovali jsme seznamy genů analýzou funkčního obohacení. Hospodářské geny se podílejí hlavně na základních buněčných funkcích a tkáňově selektivní geny nápadně souvisí s funkcemi a onemocněními odpovídajícími tkáňovému původu. Porovnali jsme také dohody a související funkce mezi našimi geny pro domácnost a těmi z předchozích studií a poukázali na některé důvody nízkého konsenzu.

Závěry

Výsledky ukazují, že dostatečné množství vzorků zlepšilo identifikaci transkriptomu tkáně kódujícího protein. Komplexní metaanalýza prokázala vysokou kvalitu námi identifikovaných genů HK a TS. Tyto výsledky by mohly nabídnout užitečný zdroj pro budoucí výzkum funkčních a genomických vlastností genů HK a TS.

Citace: Chang C-W, Cheng W-C, Chen C-R, Shu W-Y, Tsai M-L, Huang C-L a kol. (2011) Identifikace lidských domovních genů a tkáňově selektivních genů pomocí mikroarray metaanalýzy. PLoS ONE 6(7): e22859. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022859

Editor: Christian Schönbach, Kyushu Institute of Technology, Japonsko

Přijato: 20. dubna 2011 Přijato: 29. června 2011 Publikováno: 27. července 2011

Autorská práva: © 2011 Chang a kol. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný za podmínek licence Creative Commons Attribution License, která umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu za předpokladu, že je uveden původní autor a zdroj.

Financování: Tato studie je financována National Tsing Hua University, Taiwan (grant 99H11K6, http://www.nthu.edu.tw/english/index.php). Investoři neměli žádnou roli v návrhu studie, sběru a analýze dat, rozhodování o publikaci nebo přípravě rukopisu.

Konkurenční zájmy: Autoři prohlásili, že neexistují žádné konkurenční zájmy.


X chromozom

Lidská X-vázaná nemoc

Nejběžnějšími lidskými syndromy spojenými s chromozomem X jsou anomálie v počtu pohlavních chromozomů, které vznikají nedisjunkcí při meióze. Turnerův syndrom se vyskytuje přibližně u 1 z 2000 narozených žen a je způsoben ztrátou celého chromozomu vedoucí ke karyotypu XO. Aby se vysvětlilo, proč je přítomnost jediného chromozomu X škodlivá u žen XO, ale ne u mužů XY, bylo navrženo, že Turnerův syndrom je způsoben jedinou, nikoli dvojitou dávkou jednoho nebo více z mála genů, které normálně uniknou X-inaktivace. To je v souladu s pozorováním, že myši s karyotypem XO nemají zjevný fenotyp a že je hlášeno méně myších genů, které unikají X-inaktivaci. Další chromozom X je přítomen u 1 ze 600 mužů, kteří jsou pacienty s Klinefelterovým syndromem a mají karyotyp XXY. Vzácněji byly ženy také identifikovány s komplementy XXX a XXXX. Mutace nebo přeuspořádání v genech, které jsou důležité při určování primárního nebo sekundárního pohlaví, mohou vést ke vzniku žen s komplementem XY chromozomu a mužů s komplementem XX.

Mutace v jednotlivých genech vázaných na X jsou plně exprimovány u mužů a vedou k poruchám „spojeným s pohlavím“, jako je například Duchennova svalová dystrofie, která má incidenci přibližně 1 z 3 000 mužů, a syndrom křehké mentální retardace vázaný na X. s výskytem přibližně 1 z 10 000 mužů. V důsledku náhodné inaktivace jednoho z jejich dvou X chromozomů v raném vývoji jsou všechny samice mozaikou dvou populací buněk a relativní počet buněk v těchto dvou populacích se bude mezi jednotlivci lišit. Ženy heterozygotní pro mutovaný gen jsou často zcela nedotčeny, protože populace buněk exprimujících nemutovanou alelu buď poskytuje dostatečné množství normálního genového produktu, nebo během vývoje nebo diferenciace linie převažuje nad populací buněk nesoucích mutantní alelu. Některé ženské přenašečky „recesivních“ onemocnění vázaných na X však projevují některé symptomy onemocnění kvůli přirozenému vychýlení ve prospěch buněk s mutovaným X jako aktivním chromozomem. Velmi příležitostně mohou přenašečky vykazovat stejnou závažnost poruchy jako u mužů. Mutace v genech vázaných na X mohou také vést k „dominantním“ poruchám vázaným na X, které se vyskytují pouze u žen a v těchto případech se předpokládá, že postižení muži zemřou před narozením. Nejběžnějším příkladem X-vázané dominanty je Rettův syndrom, těžká progresivní neurologická porucha postihující přibližně 1 z 20 000 žen, která byla v poslední době spojována s mutacemi v genu kódujícím protein vázající methyl-CpG.


Výsledky a diskuse

V této části představujeme náš srovnávací rámec pro zkoumání rozsahu a omezení kvasinek jako modelového organismu pro studium tkáňově specifické biologie u lidí. Obrázek 1 ilustruje shrnutí naší studie na vysoké úrovni. Začneme tím, že zarovnáme každou z lidských tkáňově specifických sítí s kvasinkovým interaktomem. Spojujeme modul zarovnání s novým statistickým modelem, abychom vyhodnotili významnost každého zarovnání a použili jej k odvození příslušné podobnosti/nepodobnosti sítí specifických pro lidskou tkáň s jejich odpovídajícími protějšky v kvasinkách. Pomocí sítě podobností tkáň-tkáň vypočítaných pomocí jejich transkripčního profilu ukazujeme, že naše zarovnání sítě p-hodnoty jsou konzistentní se seskupeními odvozenými z transkripčních signatur. Tuto síť tkáňových podobností používáme k identifikaci čtyř hlavních skupin tkání/buněčných typů. Tyto skupiny představující mozkové tkáně, krevní buňky, gangliové tkáně a tkáně související s varlaty se dále používají k identifikaci tkáňově selektivních genů, které jsou aktivní v každé skupině ve srovnání se zbytkem tkání.

Shrnutí pracovního postupu. Hlavní součásti analytického rámce navrženého v tomto článku. Každý mezikrok zpracování je dále podrobně diskutován v samostatných podsekcích

Odděleně rozdělujeme jak podmnožiny lidských genů pro údržbu, tak tkáňově selektivní podskupiny lidských genů na konzervované a pro člověka specifické podsekce. Poskytujeme rozsáhlé ověření selektivních genů s ohledem na krevní buňky a mozkové tkáně. Obrázek 2 ilustruje celkové rozdělení genů a jejich relativních podskupin. Poskytujeme hloubkovou analýzu každé z těchto podmnožin a ukazujeme, že zatímco konzervované podmnožiny poskytují bezpečná zóna pro které mohou být kvasinky použity jako ideální modelový organismus, může podskupina specifická pro člověka vrhnout světlo na stínovaný podprostor lidského interaktomu v kvasinkách. Tato podskupina může poskytnout budoucí směry pro konstrukci modelů humanizovaných kvasinek.

Funkční klasifikace lidských genů. Shrnutí klasifikace genů na vysoké úrovni provedené v této studii

Zarovnání interaktomu kvasinek se sítěmi specifickými pro lidskou tkáň

The globální lidský interaktom představuje statický snímek potenciálních fyzických interakcí, které umět vyskytují se mezi páry proteinů. Neposkytuje však žádné informace týkající se časoprostorových charakteristik skutečných proteinových interakcí. Tyto interakce musí být doplněny dynamikou kontext, jako jsou měření exprese, které pomáhají interpretovat celulární přepojení za různých podmínek.

Bossi a Lehner [57] překryli úroveň exprese mRNA každého transkriptu (transkriptomu) v různých lidských tkáních [58] nad globální lidský interaktom, integrovaný z 21 databází PPI a zkonstruovaný soubor 79 referenčních tkáňově specifických sítí. Přijímáme tyto sítě a každou z nich přiřazujeme samostatně ke kvasinkovému interaktomu, který jsme zkonstruovali z databáze BioGRID.

Abychom porovnali tyto lidské tkáňově specifické sítě s kvasinkovým interaktomem, s ohledem jak na sekvenční podobnost proteinů, tak na topologii jejich interakcí, používáme nedávno navrženou metodu zarovnání řídkých sítí, založenou na přístupu Belief Propagation (BP). Tato metoda je popsána v části „Materiály a metody“ [59].

Geny a jejich odpovídající proteiny nefungují izolovaně, tvoří komplexní síť interakcí mezi spojenými biochemickými cestami, aby mohly plnit svou roli (úlohy) v modulaci buněčného aparátu. Kromě toho může být každý protein zapojen do více drah, aby vykonával různorodou sadu funkcí. Použití přístupu zarovnání sítí k projekci těchto drah napříč druhy nám umožňuje nejen zvážit jejich dynamiku prvního řádu prostřednictvím společné exprese homologních proteinových párů, ale také kontext, ve kterém jsou exprimovány.

Abychom zkonstruovali stavový prostor potenciálních homologních párů, porovnáme všechny proteinové sekvence v lidských a kvasinkových a předfiltrovaných hitech se sekvenční podobností. E-hodnoty větší než 10. Pro geny s více proteinovými izoformami ukládáme pouze nejvýznamnější zásah. Pomocí těchto homologií na úrovni sekvence zkonstruujeme matrici L který kóduje párové sekvenční podobnosti mezi kvasinkovými a lidskými proteiny. Záznamy v matici L lze nahlížet jako okrajové váhy pro bipartitní graf spojující lidské geny na jedné straně a kvasinkové geny na druhé straně. Tuto matici používáme k omezení vyhledávacího prostoru metody zarovnání sítě BP.

Parametry α a β(=1−α) řídit relativní váhu podobnosti sekvencí (v měřítku α) ve srovnání s topologickou ochranou (měřítko β) v zarovnání sítě BP. Pomocí sady předběžných simulací, které sladí globální lidský interaktom s jeho tkáňově specifickými podsítěmi, pro které máme skutečný zarovnání, s různými možnostmi α v rozsahu 0,1–0,9 identifikujeme možnosti (alpha =frac <1><6>) a (eta =frac <5><6>), abychom dosáhli nejlepšího výkonu experimenty. Ke srovnání každé tkáňově specifické sítě s kvasinkovým interaktomem používáme stejnou sadu parametrů, protože poskytuje vyvážený příspěvek ze sekvenční podobnosti a počtu konzervovaných hran. Konečná sada všech zarovnání je k dispozici ke stažení jako doplňkový soubor 1

Zkoumání rolí housekeeping genů a jejich zachování napříč druhy

Housekeeping geny zahrnují podmnožinu lidských genů, které jsou univerzálně exprimovány ve všech tkáních a jsou zodpovědné za udržování základních buněčných funkcí potřebných pro všechny tkáně, včetně translace, zpracování RNA, intracelulárního transportu a energetického metabolismu [60–62]. Tyto geny jsou ve srovnání s tkáňově specifickými geny pod silnějším selektivním tlakem a vyvíjejí se pomaleji [63]. Očekáváme proto vyšší úroveň ochrany mezi lidskými geny pro domácnost ve srovnání s geny kvasinek. Odkazujeme na nejkonzervovanější podmnožinu provozních genů mezi lidmi a kvasinkami, vypočítanou pomocí síťového zarovnání tkáňově specifických sítí se sítí kvasinek, jako jádro geny.

Gen identifikujeme jako housekeeping, pokud je exprimován v Všechno 79 tkání. Identifikujeme celkem 1 540 genů, které tvoří sdílenou část sítí specifických pro lidskou tkáň. Tyto geny, přestože mají mezi sebou podobnou sadu interakcí, jsou spojeny odlišně se sadou tkáňově selektivních genů.

S použitím partnerů pro zarovnání všech provozních genů v kvasinkovém interaktomu zkonstruujeme tabulku konzistence zarovnání o velikosti 1 540 × 79, která shrnuje zarovnání sítí ve sdílené podsekci tkáňově specifických sítí. Potom použijeme metodu většinového hlasování ke klasifikaci genů pro domácnost jako jádro, které jsou konzervované v kvasnicích, specifické pro člověka, které jsou konzistentně nezarovnané napříč lidskými tkáněmi, a nezařazeno, pro kterou nemáme dostatek důkazů, abychom ji klasifikovali jako jeden z předchozích případů.

Síťová zarovnání jsou hlučná a obsahují jak falešně pozitivní (definované jako vyrovnané páry, které spolu funkčně nesouvisí), tak i falešně negativní (páry funkčních ortologů, které při zarovnání chybí). Tyto chyby mohou pocházet z různých zdrojů, včetně dat genové exprese (chyby uzlů), interaktomu (chyby na hranách) nebo procedury zarovnání (chyby mapování). Navrhujeme metodu založenou na většinovém hlasování napříč různými skupinami, abychom (částečně) zohlednili tyto chyby. Vzhledem k sadě síťových zarovnání považujeme pár entit za konzistentně zarovnané (buď shodné nebo neshodné), pokud jsou konzistentní alespoň ve 100 ∗ τ % zarovnání v sadě. Parametr τ, nazvaný míra konsenzu, určuje úroveň přijatých neshod mezi různými zarovnáními. Vyšší hodnota míry konsenzu zvyšuje přesnost metody za cenu snížení citlivosti. Abychom vybrali optimální parametr konsensuální rychlosti, vyzkoušeli jsme hodnoty v rozsahu [ 0,5−1,0] s přírůstky (frac <1><2>) . Identifikovali jsme volbu parametru τ= 0,9, což odpovídá 90% shodě mezi srovnanými tkáněmi, aby se dosáhlo nejlepších výsledků při klasifikaci genů specifických pro člověka a konzervovaných genů při zachování dobře oddělených sad. Pomocí tohoto přístupu jsme byli schopni rozdělit 1 540 provozních genů na 595 konzervovaných, 441 lidských specifických a 504 neklasifikovaných genů. Kompletní seznam těchto genů je k dispozici ke stažení jako doplňkový soubor 2.

Abychom prozkoumali konzervovanou podsíť jádrových genů, zkonstruujeme jejich graf zarovnání jako Kroneckerův produkt podgrafu indukovaného jádrovými geny v lidském interaktomu a jeho odpovídající zarovnaný podgraf v kvasinkách. Konzervované okraje v této síti odpovídají interologům, tj. ortologním párům interagujících proteinů mezi kvasinkami a člověkem [64]. Konečný graf zarovnání základních provozních genů je k dispozici ke stažení jako doplňkový soubor 3.

Obrázek 3 ukazuje největší spojenou komponentu tohoto zkonstruovaného grafu zarovnání. Na tento graf jsme použili algoritmus shlukování sítě MCODE [65], abychom identifikovali vysoce propojené oblasti odpovídající domnělým proteinovým komplexům. Identifikovali jsme pět hlavních shluků, které jsou barevně označeny na grafu zarovnání a jsou zobrazeny samostatně na sousedních panelech. Ribozom je největší centrální shluk identifikovaný v grafu zarovnání jaderných genů a spolu s proteazomem a spliceosomem tvoří tři nejkonzervovanější komplexy v grafu zarovnání. Tento komplex je silně propojen s eIF, aby moduloval iniciaci eukaryotické translace, stejně jako proteazom, který řídí degradaci proteinů. Společně tyto komplexy regulují proteinový obrat a udržují rovnováhu mezi syntézou, zráním a degradací buněčných proteinů.

Graf zarovnání základních lidských genů. Konzervované okraje v grafu zarovnání základních provozních genů, které odpovídají „interologům“, tj. ortologním párům interagujících proteinů mezi kvasinkami a člověkem. Pět hlavních proteinových shluků, identifikovaných jako husté oblasti interakce v grafu zarovnání, je odpovídajícím způsobem označeno a označeno jejich dominantní funkční anotací takto: A ribozom, b Zpracování zavíčkované pre-mRNA obsahující intron, C proteazom, d vATPase, E Spuštění překladu závislé na čepičce

Abychom dále analyzovali funkční role těchto provozních genů, používáme balíček g:Profiler [66] R k identifikaci vysoce nadměrně zastoupených termínů. Mezi funkčními třídami se zaměřujeme na biologické procesy genové ontologie (GO), s výjimkou elektronických anotací, KEGG drah a proteinových komplexů CORUM, abychom poskytli rozmanitou sadu funkčních rolí. Ke kontrole míry falešných objevů (FDR) používáme postup Benjamini-Hochberg p-hodnotový práh α=0,05 a eliminovat všechny obohacené termíny s více než 500 geny, aby se odstranily příliš generické termíny. Pomocí tohoto postupu identifikujeme obohacené funkční termíny pro základní i pro člověka specifické podskupiny provozních genů. Kompletní seznam obohacených funkcí pro různé třídy housekeeping genů je k dispozici ke stažení jako doplňkový soubor 4.

Ručně seskupujeme nejvýznamnější výrazy (p-hodnota ≤10 −10 ) v jádrových genech, což vede k pěti hlavním funkčním třídám, jmenovitě biogenezi ribozomů, translaci, zacílení proteinů, sestřihu RNA a sledování mRNA. Nejprve pozorujeme mapování jedna ku jedné mezi obohacenými termíny a identifikovanými domnělými komplexy odpovídajícími iniciaci translace (p-hodnota =7,1 ∗ 10 −17 ) a ribozom (p-hodnota =5,97 ∗ 10 −11 ). Kromě toho jsou terminace a prodloužení translace také obohaceny o klesající úrovně významnosti. Kromě toho jsou tyto procesy úzce spojeny s kotranslačním cílením proteinů závislým na SRP (p-hodnota =2,7 ∗ 10 −15 ). To zase naznačuje syntézu proteinů jako jeden z nejkonzervovanějších aspektů eukaryotických buněk. Dále si všimneme, že oba sestřihy mRNA (p-hodnota =7,04 ∗ 10 −10 ) a úpadek zprostředkovaný nesmyslem (p-value =4.66 ∗ 10 −16 ) jsou také obohaceny mezi nejvýznamnější funkční termíny, což podporuje naši dřívější hypotézu týkající se role splicesomu v grafu zarovnání jádrových genů. Nakonec jsme zjistili, že nejvýznamnější funkční termín, stejně jako několik dalších příbuzných termínů, se účastní virové infekce, což naznačuje, že (podmnožina) jádrových genů poskytuje virová brána do savčích buněk. To lze vysvětlit ve světle dvou faktů: i) virové organismy se při svých klíčových buněčných funkcích spoléhají na hostitelský aparát a ii) geny pro údržbu jsou ve srovnání s tkáňově selektivními geny starší a jádrové geny poskytují nejkonzervovanější podmnožinu těchto genů. úklidové geny. Jako takové mohou tyto geny obsahovat více konzervovaných proteinových interakčních domén a jsou strukturálně „známější“ jako interagující partneři pro virové proteiny a poskytují ideální kandidáty pro predikci interakcí hostitel-patogen protein.

Dále provedeme podobný postup pro geny pro domácnost specifické pro člověka. Tato podmnožina, na rozdíl od jádrových genů, je většinou obohacena o termíny související s vývojem anatomické struktury a proximální komunikací mezi buňkami (parakrinní signalizace), s výjimkou komplexu I elektronového transportního řetězce, který je nejsilnějším identifikovaným termínem. Tato NADH-chinon oxidoreduktáza je největší z pěti enzymových komplexů v dýchacím řetězci savčích buněk. Tento komplex však není přítomen v kvasinkových buňkách a byl nahrazen jedinou podjednotkou NADH dehydrogenázou kódovanou genem NDI1. Poškození komplexu I je spojováno s různými lidskými poruchami, včetně Parkinsonovy a Huntingtonovy choroby. Jako úspěšný přístup k záchraně defektů komplexu I byla navržena transfekce buněk s defektem komplexu I kvasinkovým NDI1 jako terapeutickým činidlem [67, 68]. Tato technika, známá také jako terapie NDI1, otevírá zcela nové způsoby, jak mohou kvasinky přispět k výzkumu a vývoji lidských nemocí: nejen kvasinky mohou být použity jako modelový organismus, ale také mohou poskytnout kandidáty, které lze použít pro genovou terapii v savčích buňkách.

Klíčovým postřehem je, že podskupina genů pro domácnost specifická pro člověka není spojena pouze s méně funkčními termíny, ale je s těmito termíny také méně významně spojena. Tento efekt lze přičíst dvěma faktorům. Za prvé, poznamenáváme, že některé z genů, u nichž se předpokládá, že jsou specifické pro člověka, mohou být artefaktem této metody. Například metoda propagace víry (BP) vynucuje sekvenční podobnost jako nezbytnou, ale ne postačující podmínku pro pár genů, které mají být zarovnány, což znamená, že jakýkoli lidský gen, který nemá sekvenční podobnost s kvasinkovými geny, nebude zarovnán. v genech, které jsou uměle klasifikovány jako specifické pro člověka. Za druhé, a co je důležitější, většina funkčních anotací lidských genů je zpočátku připisována jiným druhům, zvláště kvasinkám, a přenášena přes ortologické skupiny. Na základě naší konstrukce jsou geny specifické pro člověka definovány jako podmnožina provozních genů bez ortologie s kvasinkami. Jako takové lze očekávat, že tyto geny pokrývají stínovaný podprostor funkčního prostoru lidských genů, který je podkomentován.

Kvantifikace podobnosti lidských tkání s kvasinkami

Housekeeping geny jsou sdíleny ve všech lidských tkáních a typech buněk. Poskytují konzervovaný soubor funkcí, které jsou zásadní pro buněčnou homeostázu. Tyto geny však neposkytují přímý pohled na to, jak různé tkáně využívají tyto klíčové funkce k tomu, aby vykazovaly své dynamické, tkáňově specifické vlastnosti. Pro posouzení podobnosti každé tkáně s kvasinkami navrhujeme nový statistický model, tzv tkáňově specifický náhodný model (TRAM), který bere v úvahu všudypřítomnou povahu provozních genů a napodobuje topologickou strukturu tkáňově specifických sítí (podrobnosti o náhodném modelu naleznete v části „Materiály a metody“).

Jako objektivní funkci používáme skóre zarovnání každého páru tkáň-kvasinka. Abychom vyhodnotili významnost každého skóre srovnání, používáme simulační metodu Monte Carlo k odběru vzorků ze základního rozdělení pravděpodobnosti skóre srovnání.

Pro každou tkáňově specifickou síť vzorkujeme (k_<oldsymbol >> = 10 000) pseudonáhodných tkání stejné velikosti z TRAM, odděleně je zarovnejte s kvasinkovým interaktomem a vypočítejte počet konzervovaných hran a sekvenční podobnost zarovnaných proteinových párů jako statistiku zarovnání, aby bylo možné vypočítat empirické p-hodnoty. Pro každé zarovnání sítě vypočítáme a topologické, a homologický (na základě sekvence) a a smíšený (skóre zarovnání) p-hodnota. Kromě toho používáme případy, kdy je kvalita zarovnání výrazně lepší v původním zarovnání tkání, a to jak z hlediska sekvence, tak topologie, ke kvantifikaci horní hranice na zarovnání p-hodnoty. Naopak případy, ve kterých jsou obě tato opatření zlepšena v náhodných vzorcích, mohou být použity k definování a spodní hranice na zarovnání p-hodnota. Konečná tabulka zarovnání p-values ​​je k dispozici ke stažení jako doplňkový soubor 5.

Nejprve si všimneme, že všechny tkáně s významnými smíšený p-hodnoty mají také významné topologické a homologické (sekvenční) p-hodnoty. Pro většinu tkání s nevýznamnými smíšený p-hodnoty, stále pozorujeme výrazné homologické, ale nevýznamné topologické p-hodnoty. Shrneme nejvíce a nejméně podobné tkáně kvasinkám použitím prahové hodnoty α l=α u=10 −2 k p-hodnota horní a dolní hranice. Za použití p-hodnota horní hranice ( (Delta _<oldsymbol >>) ) z 10 −2 identifikujeme celkem 23 ze 79 tkání s vysokou podobností s kvasinkami. Ty jsou uvedeny v tabulce 1. Mezi nimi krevní buňky trvale vykazují vysokou významnost, aniž by i jediný případ z 10 000 vzorků měl buď váhu srovnání nebo přesah okraje náhodného vzorku přesahující původní srovnání. Podobně i imunitní buněčné linie a mužské reprodukční tkáně také vykazují významné zarovnání p-hodnoty, ale s nižším skóre spolehlivosti. Naopak, existuje 19 ze 79 tkání, které mají (delta _<oldsymbol >> > 10^<-2>) . Ty jsou nejméně podobné kvasnicím. Mezi těmito tkáněmi, uvedenými v tabulce 2, gangliové tkáně trvale vykazují nejmenší podobnost s kvasinkami. Zajímavým pozorováním je, že tkáně a typy buněk na obou koncích tabulky (buď nejvíce nebo nejméně podobné) mají obvykle velmi vysoké skóre spolehlivosti, což je jak jejich topologie, tak homologie. p- hodnoty jsou konzistentní.

Identifikace skupin koherentních tkání

Dále zkoumáme korelaci mezi podobností lidských tkání mezi sebou a tím, jak souvisí s jejich odpovídajícím zarovnáním p-hodnoty s kvasinkami, abychom lépe pochopili tranzitivitu tohoto vztahu. Očekáváme, že podobné tkáně by měly vykazovat konzistentní zarovnání p-hodnoty, což vede ke skupinám homogenních tkání s koherentním skóre zarovnání.

Za tímto účelem nejprve zkonstruujeme síť tkáňových podobností (TTSN) pomocí globálního transkriptomu lidských tkání z GNF Gene Atlas, včetně 44 775 lidských transkriptů pokrývajících jak známé, tak i předpokládané a špatně charakterizované geny. Pro každý pár tkání/buněčných typů vypočítáme skóre podobnosti pomocí Pearsonovy korelace jejich transkripčních signatur a použijeme 90. percentil skóre podobnosti k výběru nejpodobnějších párů. Každý uzel v TTSN označíme jeho odpovídajícím zarovnáním p-hodnota jako míra podobnosti s kvasinkovým interaktomem. Tato metaanalýza nám umožňuje zkoumat, jak se lineární měření aktivity genu/proteinu promítají do prostoru proteinových interakcí, aby bylo možné přepojit základní interaktom v každé lidské tkáni.

Obrázek 4 představuje konečnou síť. V této síti každý uzel představuje typ lidské tkáně/buňky a každý vážený okraj ilustruje rozsah celkové transkripční podobnosti mezi páry tkání. Tato síť je filtrována tak, aby zahrnovala pouze tkáňové páry, které se navzájem nejvíce překrývají. Abychom každému uzlu přiřadili barvu, používáme z-normalizace skóre na log-transformovaném zarovnání smíšené p-hodnoty. Zelené a červené uzly odpovídají vysoce pozitivnímu a vysoce negativnímu rozsahu z-skóre, které představují podobné a nepodobné tkáně jako kvasinky.

Projekce vyrovnání p-hodnoty na síti tkáňových podobností. Každý uzel představuje lidskou tkáň a okraje představují mezi nimi celkovou transkripční podobnost. Intenzita barvy uzlů představuje podobnost/nepodobnost každé tkáně s kvasinkovým interaktomem, přičemž barvy zelené a červené odpovídají podobným a odlišným tkáním. Skupina podobných tkání s koherentní p-hodnoty jsou v síti odpovídajícím způsobem označeny a anotovány

Předběžná analýza této sítě ukazuje, že zarovnání p-hodnota tkání vysoce koreluje s jejich celkovým transkripčním přesahem. Kromě toho se tyto interakce na vysoké úrovni vzájemně shodují a spadají do odlišných skupiny s konzistentními vzory. Ručně jsme identifikovali čtyři takové skupiny a samostatně je anotovali v síti. Tyto skupiny odpovídají mozkové tkáni, krvinkám, gangliovým tkáním a tkáním varlat. Mezi těmito skupinami vykazují krevní buňky a tkáně varlat konzistentní podobnost s kvasinkami, zatímco mozkové a gangliové tkáně vykazují konzistentní odlišnosti.

Existence homogenní skupiny tkání s konzistentní podobností s kvasinkami naznačuje základní konzervovaný mechanismus v těchto shlucích. To vyvolává otázku, co je konzistentně zarovnáno v rámci každé skupiny tkání a jak to souvisí s vypočítaným zarovnáním p-hodnoty? Touto otázkou se zabýváme a vztahujeme ji k nástupu tkáňově specifických patologií ve zbývajících podkapitolách.

Rozebírání tkáňově selektivních genů s ohledem na jejich konzervaci

V tomto pododdílu zkoumáme podmnožinu non-housekeeping genů v každé homogenní skupině lidských tkání a rozdělujeme je do sad genů a jejich odpovídajících drah, které jsou buď konzervované v kvasinkách, nebo jsou specifické pro člověka. Dále analyzujeme, jak tyto dráhy přispívají k celkové podobnosti/nepodobnosti lidských tkání s kvasinkami.

Obrázek 5 představuje funkci hustoty pravděpodobnosti pro distribuci členství mimo provozovnu genů v různých lidských tkáních. Pozorovaná bimodální distribuce naznačuje, že většina non-housekeeping genů je exprimována buď ve velmi malém počtu vybraných tkání, nebo ve většině lidských tkání. Toho využíváme k rozdělení sady exprimovaných non-housekeeping genů s cílem identifikovat geny, které jsou selektivně exprimovány v každé skupině lidských tkání.

Členská distribuce non-housekeeping genů v lidských tkáních. Počet tkání, ve kterých jsou exprimovány non-housekeeping geny, je vyhlazen pomocí Gaussovy hustoty jádra. Pozorovaná bimodální distribuce naznačuje, že většina non-housekeeping genů je exprimována buď v několika vybraných tkáních, nebo ve většině lidských tkání.

Začínáme se všemi exprimované non-housekeeping geny v každé tkáňové skupině, tj. geny, které jsou exprimovány v alespoň jeden z členů tkáně. Dále, aby se identifikovala podskupina exprimovaných genů, které jsou selektivně vyjádřeno v každé skupině, používáme p-hodnota tkáňové selektivity každého genu. V této formulaci je gen identifikován jako selektivně exprimovaný, pokud je exprimován ve výrazně vyšším počtu tkání v dané skupině než náhodně vybrané podskupiny tkání stejné velikosti (podrobnosti viz část „Materiály a metody“). Obrázek 6 znázorňuje distribuci tkáňové selektivity p-hodnoty exprimovaných genů vzhledem ke čtyřem hlavním skupinám na obr. 4. Každý z těchto grafů vykazuje bimodální charakteristiku podobnou distribuční funkci členství na obr. 5. To lze vysvětlit skutečností, že distribuce členství je směsí distribuce, přičemž základní složky jsou stejné distribuce pro podskupinu genů, které jsou exprimovány v různých tkáňových skupinách. Používáme kritické body p-distribuce hodnot k prahu pro tkáňově selektivní geny. Motivací naší volby je, že tyto body poskytují posuny v základní distribuci, od tkáňově selektivních k všudypřítomným genům. Vzhledem k bimodálním charakteristikám těchto distribucí mají všechny tři kritické body, z nichž první používáme jako hraniční bod. To poskytuje nejvyšší přesnost pro deklarované tkáňově selektivní geny, ale nižší vybavitelnost než ostatní dvě možnosti.

Distribuce tkáňové selektivity p-hodnoty v různých skupinách tkání. A mozkové tkáně, b Krvinky, C gangliové tkáně, d Tkáně varlat. Každý graf se podobá stejné bimodální distribuci jako hustota členství v genu a tkáni, přičemž krevní buňky a mozkové tkáně představují nejjasnější oddělení tkáňově selektivních genů. Na každém grafu jsou vyznačeny kritické body každé distribuční funkce, kde je derivace funkce pdf přibližně nulová. Tyto body poskytují optimální hraniční body pro tkáňovou selektivitu p-hodnoty, které označují body posunu v základní distribuční funkci

Poté, co jsme identifikovali podskupinu tkáňově selektivních genů s ohledem na každou tkáňovou skupinu, použijeme schéma většinového hlasování k rozdělení těchto sad na tři části na základě jejich souladu s kvasinkami. Podobně jako u postupu, který jsme použili u tri-partition housekeeping genů, jsme vyzkoušeli různé volby parametru konsenzuální míry od 50–100 % s přírůstky po 5 %. Procento neklasifikovaných genů lineárně klesá s mírou konsenzu, zatímco relativní části genů specifických pro člověka/konzervovaných zůstávají stejné. Pro naše konečné výsledky jsme vybrali 90 %, protože ponechává nejmenší počet genů jako neklasifikovaných, a přitom dobře oddělené geny specifické pro člověka a konzervované geny. Sada všech tkáňově specifických genů je k dispozici ke stažení jako doplňkový soubor 6.

Tabulka 3 uvádí počet exprimovaných genů, selektivně exprimovaných genů a procento tkáňově selektivních genů, které jsou konzervované, lidské specifické nebo neklasifikované v každé skupině tkání. Existuje podobný vztah mezi poměrem konzervovaných/lidsky specifických genů v každé skupině tkání a jejich uspořádáním p-hodnoty, což naznačuje toto zarovnání p-hodnoty vysoce korelují s konzervací tkáňově selektivních genů a jejich odpovídajících drah. Obrázek 7 ilustruje relativní velikosti každé podskupiny genů identifikovaných v této studii.

Shrnutí klasifikací genů v této studii. Housekeeping a tkáňově selektivní geny ve čtyřech hlavních skupinách lidských tkání jsou klasifikovány do tří hlavních tříd na základě jejich konzervace v kvasinkách.

Konzervované geny a jejich odpovídající dráhy tvoří funkční podprostor, ve kterém můžeme kvasinky využít jako vhodný modelový organismus pro studium tkáňově specifické fyziologie a patofyziologie. Na druhé straně geny specifické pro člověka poskytují komplementární sadu, kterou lze použít ke konstrukci tkáňového inženýrství modely humanizovaných kvasinek. Poskytují také slibné kandidáty pro tkáňově specifické genové terapie podobným způsobem jako terapie NDI1 v případech, kdy lze v kvasinkách nalézt alternativní funkční mechanismus. Abychom dále prozkoumali tyto podskupiny, zaměřujeme se na krevní buňky a mozkové tkáně, které ilustrují nejjasnější oddělení mezi jejich tkáňově selektivními a konzervovanými geny v jejich distribuci TSS, a podrobujeme je podrobnější funkční analýze v dalších podsekcích.

Objasnění funkčních rolí mozku a krevních selektivních genů

Používáme g:ProfileR na geny specifické pro člověka i na konzervované geny k identifikaci jejich obohacených funkcí. Úplný seznam obohacených funkcí je k dispozici ke stažení jako doplňkový soubor 7. Tyto dvě podskupiny sdílejí mnoho společných pojmů, protože obě jsou podskupinami tkáňově selektivních genů. Pro komparativní analýzu těchto funkcí a jejich seřazení na základě jejich lidské specifičnosti používáme log of p-hodnotové poměry mezi lidskými specifickými a konzervovanými geny pro filtrování termínů, které jsou alespoň v rámci 2násobného obohacení. Zaměřujeme se na biologické procesy GO, KEGG dráhy a proteinové komplexy CORUM a odstraňujeme všechny genové sady s více než 500 geny, abychom filtrovali příliš obecné termíny. Nakonec, abychom seskupili tyto termíny a poskytli vizuální reprezentaci funkčního prostoru genů, použijeme EnrichmentMap (EM) [69], nedávný zásuvný modul Cytoscape [70], abychom vytvořili síť (mapu) obohacených termínů. . Použijeme log poměr p-hodnoty pro obarvení každého uzlu v grafu. Obrázky 8 a 9 ilustrují konečnou mapu obohacení unikátních lidských specifických a konzervovaných krvně selektivních a mozkově selektivních funkcí, v daném pořadí.

Mapa obohacení unikátních krvně selektivních funkcí.Každý uzel představuje funkční člen a tloušťka hran odpovídá rozsahu překrývání mezi členy. Zachovaná a pro člověka specifická sada funkcí je barevně odlišena zelenou a červenou barvou. Intenzita barev uzlů představuje obohacení výrazů. Související termíny jsou vyznačeny a komentovány v mapě obohacení

Mapa obohacení unikátních mozkově selektivních funkcí. Každý uzel představuje funkční člen a tloušťka hran odpovídá rozsahu překrývání mezi členy. Zachovaná a pro člověka specifická sada funkcí je barevně odlišena zelenou a červenou barvou. Intenzita barev uzlů představuje obohacení výrazů. Související termíny jsou vyznačeny a komentovány v mapě obohacení

Konzervované krevní selektivní funkce, znázorněné na obr. 8a, jsou primárně obohaceny o termíny související s replikací DNA, buněčným růstem a přípravou buňky na buněčný cyklus. Mezi těmito termíny je replikace DNA úzce spojena s termíny týkajícími se opravy DNA a údržby telomer. Udržování telomer, speciálně prostřednictvím enzymu telomerasy, je jednou z buněčných funkcí, o kterých je známo, že jsou u kvasinek zachovány, ale jsou aktivní pouze ve vybrané podskupině diferencovaných lidských tkání a typů buněk, včetně hematopoetických kmenových buněk a mužských reprodukčních tkání [71]. Funkční termíny zapojené do změn konformace DNA, včetně komplexu kondenzinu, stejně jako fázový přechod buněčného cyklu, konkrétně z G1 do S fáze, jsou dvě další skupiny konzervovaných funkčních termínů, které jsou vysoce konzervované od kvasinek k člověku. Na druhé straně funkce selektivní pro lidskou krev, znázorněné na obr. 8b, se podílejí hlavně na proliferaci a aktivaci lymfocytů. Pojmy v těchto dvou skupinách spolu také úzce souvisí a tvoří spolu větší shluk. Kromě toho produkce cytokinů a cytotoxicita zprostředkovaná T-buňkami také vykazují pro člověka specifické, krev selektivní charakteristiky. To se částečně očekává, protože tyto funkce jsou vysoce specializované funkce imunitních buněk, které se vyvíjejí zejména u lidí, aby zajistily jeho přežití v méně příznivých podmínkách.

Obrázek 9a ukazuje funkční prostor konzervovaných mozkově selektivních funkcí. Mnohé z těchto pojmů odpovídají různým aspektům vývoje mozku, včetně vývoje čichového bulbu, telencephala, pallia a mozkové kůry, stejně jako regulačnímu okruhu, který řídí vývoj nervového systému. Vzhledem k jednobuněčné povaze kvasinek jsou přesné mechanismy, kterými ortologové těchto drah modulují buněčný aparát kvasinek, méně studovány. Hloubková analýza k identifikaci odpovídajících fenologů nám může pomoci použít kvasinky ke studiu různých poruch souvisejících s vývojem mozku. Dalším funkčním aspektem, který vykazuje vysokou konzervaci, je mTOR komplex 2. Cílem rapamycinové (TOR) signalizace je vysoce konzervovaná dráha, která tvoří dva strukturně odlišné proteinové komplexy, mTORC1 a mTORC2. Prvně jmenovaný komplex má ústřední roli při snímání živin a růstu buněk a jako takový byl široce používán ke studiu prodloužení životnosti zprostředkované omezením kalorií (CR). Na druhé straně byl nedávno navržen mTORC2 k modulaci konsolidace dlouhodobé paměti [72]. Biosyntéza a transport cholesterolu je dalším konzervovaným funkčním aspektem, který se významně liší od jiných lidských tkání. Exprese genů odpovídajících lipoproteinovým receptorům a apolipoproteinům jako orgán v těle nejvíce bohatý na cholesterol je mezi různými mozkovými buňkami přísně regulována a hraje důležitou roli v normálním vývoji mozku. Dysregulace těchto metabolických drah se podílí na různých neurologických poruchách, jako je Alzheimerova choroba [73]. Konečně, mikrotubulární struktura a tubulinová polymerace také vykazují významnou konzervaci a je známo, že hrají klíčovou roli ve vývoji mozku [74]. Tyto cytoskeletální proteiny byly nedávno spojovány s mozkově specifickými patologiemi, včetně epilepsie [75].

Nakonec studujeme mozkové funkce specifické pro člověka, které jsou znázorněny na obr. 9b. Jedním z klíčových funkčních aspektů v této skupině je signální dráha semaforin-plexin. Tato dráha byla zpočátku charakterizována na základě její role ve zrání anatomické struktury mozku, konkrétně prostřednictvím odpudivého vedení axonů, ale později bylo zjištěno, že je nezbytná pro morfogenezi široké škály orgánových systémů, včetně smyslových orgánů a vývoje kostí [76] ]. Další signální dráha specifická pro člověka identifikovaná v mozku je signální dráha glutamátového receptoru, která také propojuje cirkadiánní strhávání, stejně jako přenos neuron-neuron. Tato dráha hraje kritickou roli v neurální plasticitě, neurálním vývoji a neurodegeneraci [77]. Je také spojován jak s chronickými mozkovými chorobami, jako je schizofrenie, tak s neurodegenerativními poruchami, jako je Alzheimerova choroba [78].

U tkáňově specifických patologií hrají důležitou roli jak konzervované, tak lidské specifické geny. Kromě toho tyto geny, které jsou obohaceny o regulační a signalizační funkce, propojují s provozními geny, aby řídily buněčnou odpověď na různé faktory. Úplného obrazu o nástupu, vývoji a progresi onemocnění lze tedy dosáhnout pouze ze systémového hlediska. Z tohoto pohledu studujeme nejen geny (nebo jejich stavy), které se často mění při onemocnění, ale také základní tkáňově specifické a provozní cesty, ve kterých interagují a vykazují pozorovaný fenotyp(y). V další podkapitole tuto hypotézu dále prozkoumáme. Studujeme potenciál různých podskupin identifikovaných tkáňově selektivních genů pro predikci tkáňově specifických patologií.

Posouzení významu tkáňově specifických patologií mezi konzervovanými a lidskými tkáňově selektivními geny

K dalšímu studiu prediktivní schopnosti tkáňově selektivních genů pro lidské patologie používáme databáze genetických asociací (GAD) anotace onemocnění jako náš zlatý standard [79]. Tato databáze shromažďuje asociace genů a onemocnění ze studií genetických asociací. Kromě toho bylo každé onemocnění přiřazeno k jedné z 19 různých tříd onemocnění v databázi GAD. K analýze obohacení o onemocnění tkáňově selektivních genů používáme funkční anotační nástroj DAVID [80].

Nejprve se snažíme identifikovat, které třídy onemocnění jsou významně obohaceny mezi každou sadou tkáňově selektivních genů. Tabulka 4 ukazuje třídy onemocnění obohacené v každé skupině mozkových a krevních selektivních genů. Konzervované geny selektivní pro krev jsou převážně obohaceny o rakovinu, zatímco geny selektivní pro lidskou krev jsou spojeny hlavně s imunitními poruchami. To může být spojeno s našimi předchozími výsledky, které ukazují, že konzervovaná podskupina se podílí hlavně na regulaci růstu, replikace DNA a buněčného cyklu, zatímco geny specifické pro člověka se primárně podílejí na proliferaci a aktivaci lymfocytů. Naopak geny selektivní pro mozek vykazují vyšší podobnosti z hlediska tříd onemocnění, které mohou předvídat. Jak konzervované geny, tak geny selektivní pro lidský mozek mohou předpovídat psychiatrické poruchy, ale podskupina specifická pro člověka se zdá být přesnějším prediktorem. Na druhé straně neurologické poruchy jsou obohaceny pouze o lidskou specifickou podskupinu mozkově selektivních genů, zatímco poruchy klasifikované jako farmakogenomické a chemdependence vykazují vyšší obohacení o konzervované geny.

Abychom shrnuli specifické poruchy, které jsou obohaceny každou podskupinou mozkově selektivních genů, integrujeme všechny identifikované nemoci a seřadíme je na základě jejich obohacení. p-hodnota, pokud je obohacena pouze v jednom souboru, nebo jejich nejvýznamnější p-hodnota, pokud je obohacena v obou souborech. Tabulka 5 ukazuje prvních deset chorobných termínů obohacených buď o lidské specifické nebo konzervované geny selektivní pro mozek. Ve většině případů jsou geny specifické pro člověka výrazněji spojeny se specifickými patologiemi mozku než geny konzervované. Kromě toho existují jedinečné poruchy, jako je schizofrenie, bipolární porucha a záchvaty, které jsou obohaceny pouze o geny specifické pro člověka.

Závěrem lze říci, že jak konzervované, tak pro člověka specifické podskupiny tkáňově selektivních genů jsou významně spojeny s různými lidskými poruchami. Avšak podskupina specifická pro člověka vykazuje vyšší asociaci s tkáňově specifickými patologiemi. Za tímto účelem nás vedou k vhodným molekulárním konstruktům (inzercím genů) v kvasinkách, abychom prozkoumali molekulární/funkční mechanismy, které způsobují tkáňově specifickou dysfunkci. Takové mechanismy mohou být testovány na lidech, a pokud jsou validovány, mohou kvasinky sloužit jako experimentální model pro další zkoumání biomarkerů a farmakologických a genetických intervencí.


Materiály a metody

Načítání celé genomové sekvence

Celá genomová sekvence 92 půdních bakterií byla získána z Integrated Microbial Genome Database (Markowitz et al., 2012) a NCBI genomové databáze (Benson et al., 2006). Selekce těchto bakteriálních druhů byla provedena po důkladném potvrzení jejich půdní povahy po konzultaci s dostupnou literaturou včetně Bergey's Manuál systematické bakteriologie (Garrity a kol., 2001 Brenner a kol., 2005 Vos a kol., 2009 Krieg a kol. ., 2010 Whitman et al., 2012) a metadata spojená s příslušnými genomovými daty. Genomy bakteriálních druhů s nesprávnými metadaty týkajícími se lokality a zdroje izolace a neúplnou anotací kódujících sekvencí byly záměrně vyřazeny z analýzy. Návrh genomů bakteriálních druhů také nebyl pro analýzu uvažován. Druhy bez demarkace kmene byly také vynechány, protože ‘kmen' tvoří nedílnou součást konceptu bakteriálních druhů (Rosselló-Mora a Amann, 2001). Vybraných 92 bakteriálních druhů uvažovaných v této studii je rozšířeno po celé eubakteriální doméně patřící do pěti různých taxonomických tříd (jmenovitě Proteobacteria, Firmicutes, Chlorobi, Actinobacteria a Acidobacteria) rozšířených do 20 různých řádů a 27 různých čeledí. Seznam těchto organismů je uveden v doplňkové tabulce 1. Pro každý genom byly zvažovány geny se správnými iniciačními a terminačními kodony, aby se minimalizovala chyba při odběru vzorků.

Získávání sekvencí genu 16S rRNA a housekeepingu

Nukleotidové sekvence genu 16S rRNA a sekvence provozních genů atpD, infB, rpoB, a trpB z 92 bakteriálních rodů bylo vytěženo z celých sekvencí genomu ke studiu profilu využití kodonů a konstrukci vícenásobného zarovnání sekvencí (MSA) k odvození fylogenetických vztahů.

Analýza CUB

Byly vypočteny parametry jako efektivní počet kodonů nebo Nc (Wright, 1990), obsah GC na třetí pozici kodonu nebo GC3 (Wright, 1990), hydrofobnost a délka genu. Nc je jedním z nejlepších a široce používaných měřítek, které kvantifikuje rozsah, v jakém se použití genu odchyluje od rovného použití synonymních kodonů (Fuglsang, 2006 Liu, 2013). Pohybuje se od 20 do 61. Hodnota Nc nižší než 40 znamená zkreslení využití kodonů a vyšší než 40 znamená stejné pravděpodobné použití všech synonymních kodonů (Botzman a Margalit, 2011 Pal et al., 2015 Wang et al., 2018 Khandia et al. ., 2019). Uvádí se, že GC3 je spojen s flexibilitou DNA a zkreslením kodonů napříč prokaryoty (Babbitt et al., 2014) a také hraje regulační roli v genové expresi a methylaci (Tatarinova et al., 2013). V této studii byl GC3 vypočten jak pro celý genom, tak pro každý housekeeping gen. Hydrofobnost se ve skutečnosti používá k predikci povahy buněčného proteinu kódovaného odpovídajícím genem přítomným v genomu. Hodnota pod nulou označuje přítomnost hydrofilního proteinu a nad nulou představuje přítomnost hydrofobního proteinu (Magdeldin et al., 2012). V naší studii jsme tento parametr použili k odhadu fyzikální vlastnosti hydrofobnosti produktů housekeeping genu kódovaných rpoB, atpD, infB, a trpB gen. Nc graf znázorňující korelaci mezi Nc a GC3 (Wright, 1990) byl zkonstruován pro určení variace v interspecifických i intergenových synonymních vzorcích použití kodonů existujících v celém genomu a provozních genech půdních bakterií. Nc graf se široce používá k objasnění mechanistických sil formujících CUB a heterogenity genu pomocí zkreslení kodonů a složení bází (Sun et al., 2016 Wang et al., 2018 Khandia et al., 2019). V této studii byly výše uvedené parametry odhadnuty pro celé genomy a housekeeping geny pomocí INCA (Supek a Vlahovicek, 2004) a CodonW (Peden, 1999).

Generování zarovnání více sekvencí (MSA)

MSA genů 16S rRNA a čtyř provozních genů z 92 bakteriálních druhů byly připraveny pomocí webového rozhraní Clustal Omega hostovaného na webových stránkách EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo /). Clustal Omega je nástroj MSA, který vytváří zarovnání mezi více sekvencemi pomocí nasazených vodících stromů a technik profilu profilu HMM (Sievers et al., 2011).

Fylogenetická analýza

Fylogenetické závěry s použitím genu 16S rRNA a čtyř provozních genů byly odvozeny pomocí metody maximální pravděpodobnosti (ML). Pokud jde o přesnost, čas a pohodlí, je metoda ML považována za jednu z nejvhodnějších metod odhadu stromů poskytující informace o evolučních vztazích (Mulet et al., 2010). Kromě toho tato metoda využívá věrohodnostní funkci a lze ji snadno použít k detekci párových vzdáleností ve fylogramech (Rong a Huang, 2014). Protože evoluční modely (nebo modely nukleotidové substituce) jsou klíčovou složkou molekulární fylogenetiky využívající metody, jako je ML, pro každý gen, byl pomocí modelové testovací funkce MEGA 6.0 vybrán optimální model evoluce (Kumar et al., 2008 ). Hodnota Bayesian Information Criterion (BIC) byla považována za základní kritérium pro výběr modelu a modely zobrazující nejnižší hodnotu BIC byly vybrány jako optimální modely (Posada a Buckley, 2004 Posada, 2009 Luo et al., 2010). Fylogenetické stromy byly konstruovány pomocí MEGA 6.0 (Kumar et al., 2008). Pro čtyři provozní geny uvažované v této studii, model General Time Reversible (Nei a Kumar, 2000) s gama (G) distribuovanou variací rychlosti mezi místy spolu s významným podílem neměnných míst (I) nebo GTR + G &# Model x0002B I byl shledán jako optimální na základě skóre BIC. Fylogenetický strom založený na genu 16S rRNA byl odvozen na základě Kimurova 2-parametrového modelu (Kimura, 1980). Bootstrap consensus tree odvozený z 1000 replikátů (Felsenstein, 1985) byl vzat jako reprezentující evoluční historii analyzovaných taxonů. Vizualizace a anotace fylogenetických stromů byly provedeny pomocí online open source nástroje Interactive Tree of Life (iTOL) ver. 4.4.2 k dispozici na https://itol.embl.de/ (Letunic and Bork, 2007, 2019). Nezpracovaná data obsahující fylogenetické stromy spolu s podporou bootstrapu jsou poskytovány jako doplňkové soubory ve formátu Newick.


Jak můžete vidět výše, zesilovače mohou zapnout promotory genů umístěných tisíce párů bází daleko. Izolátory brání zesilovači, aby se nevhodně navázal na promotor nějakého jiného genu ve stejné oblasti chromozomu a aktivoval jej.

  • úseky DNA (stačí jen 42 párů bází)
  • umístěný mezi
    • zesilovač(e) a promotor(y) nebo
    • tlumič(y) a promotor(y)

    Enhancer pro promotor genu pro delta řetězec gama/delta T-buněčný receptor pro antigen (TCR) se nachází v blízkosti promotoru pro alfa řetězec alfa/beta TCR (na chromozomu 14 u lidí). T buňka si musí vybrat mezi jedním nebo druhým. Mezi promotorem alfa genu a promotorem delta genu je izolátor, který zajišťuje, že se aktivace jednoho nerozšíří na druhý.

    Všechny dosud objevené izolátory u obratlovců fungují pouze tehdy, jsou-li vázány na CTCF protein. Další příklad: U savců (myši, lidé, prasata) pouze alela pro inzulínu podobný růstový faktor-2 (IGF2) zděděná po otci je aktivní, která zděděná po matce není &mdash fenomén tzv. otiskování.

    Mechanismus: mateřská alela má izolátor mezi IGF2 promotor a zesilovač. Stejně tak alela otce, ale v jeho případě byl izolátor methylován. CTCF se již nemůže vázat na izolátor, a tak zesilovač nyní může zapnout otcovu IGF2 promotér.

    Mnoho komerčně důležitých odrůd prasat bylo vyšlechtěno tak, aby obsahovaly gen, který zvyšuje poměr kosterního svalstva k tuku. Tento gen byl sekvenován a ukázalo se, že jde o alelu IGF2, která obsahuje jedinou bodovou mutaci v jedné ze svých introny. Prasata s touto mutací produkují vyšší hladiny IGF2 mRNA v jejich kosterních svalech (ale ne v jejich játrech). To nám říká, že:

    • Mutace nemusí být v části genu kódující protein, aby ovlivnily fenotyp.
    • Mutace v nekódujících částech genu mohou ovlivnit, jak tento gen je regulované (zde změna ve svalu, ale ne v játrech).

    Geny nejsou osud

    Geny ovlivňují každý aspekt lidské fyziologie, vývoje a adaptace. Obezita není výjimkou. Přesto je relativně málo známo o specifických genech, které přispívají k obezitě, ao rozsahu takzvaných “interakcí s genetickým prostředím” složité souhře mezi naší genetickou výbavou a našimi životními zkušenostmi.

    Studie z roku 2014 zjistila, že konzumace smaženého jídla by mohla interagovat s geny souvisejícími s obezitou, což podtrhuje důležitost snížení spotřeby smaženého jídla u jedinců geneticky predisponovaných k obezitě. (21) Hledání genů lidské obezity začalo před několika desetiletími. Rychlé pokroky v molekulární biologii a úspěch projektu Human Genome Project zintenzivnily hledání. Tato práce osvětlila několik genetických faktorů, které jsou zodpovědné za velmi vzácné, jednogenové formy obezity. Rozvíjející se výzkum také začal identifikovat genetické základy takzvané „běžné“ obezity, která je ovlivněna desítkami, ne-li stovkami genů. Výzkum vztahu mezi určitými potravinami a obezitou navíc vrhá více světla na interakci mezi stravou, geny a obezitou.

    Z těchto raných zjištění je stále jasnější, že dosud identifikované genetické faktory přispívají k riziku obezity jen nepatrně – a že naše geny nejsou naším osudem: Mnoho lidí, kteří jsou nositeli těchto takzvaných “genů obezity”, ne mít nadváhu a zdravý životní styl může těmto genetickým vlivům čelit. Tento článek stručně nastiňuje přínos genů a interakcí mezi geny a prostředím k rozvoji obezity.

    Vzácné formy obezity způsobené mutacemi v jediném genu (monogenní obezita)

    Několik vzácných forem obezity je výsledkem spontánních mutací v jednotlivých genech, tzv. monogenních mutací. Takové mutace byly objeveny v genech, které hrají zásadní roli při kontrole chuti k jídlu, příjmu potravy a energetické homeostáze – především v genech, které kódují hormon leptin, leptinový receptor, proopiomelanokortin a melanokortinový receptor, mimo jiné. . (1)

    Obezita je také charakteristickým znakem několika genetických syndromů způsobených mutací nebo chromozomálními abnormalitami, jako jsou syndromy Prader-Willi a Bardet-Biedl. U těchto syndromů je obezita často doprovázena mentální retardací, reprodukčními anomáliemi nebo jinými problémy. (2)

    “Běžná obezita” způsobená mutacemi ve více genech

    V 21. století je obezita zdravotním problémem, který postihuje bohaté i chudé, vzdělané i nevzdělané, westernizované i newesternizované společnosti. Hladina tělesného tuku se však liší od člověka k člověku a někteří lidé měli vždy tendenci mít o něco více tělesného tuku než jiní. Důkazy ze zvířecích modelů, studií lidských vazeb, studií dvojčat a asociačních studií velkých populací naznačují, že tato variace v naší náchylnosti k obezitě má genetickou složku. Předpokládá se však, že náchylnost k běžné obezitě je spíše než řízena jediným genem ovlivněna mnoha geny (polygenní).

    Studie dvojčat nabízí určitý pohled na genetiku běžné obezity. Na základě údajů od více než 25 000 párů dvojčat a 50 000 biologických a adoptivních rodinných příslušníků jsou odhady středních korelací pro index tělesné hmotnosti (BMI) 0,74 pro monozygotní (“identická”) dvojčata, 0,32 pro dizygotická (“ bratrská 8221) dvojčata, 0,25 pro sourozence, 0,19 pro páry rodič-potomek, 0,06 pro adoptivní příbuzné a 0,12 pro manžele. (3) Silná korelace BMI mezi monozygotními dvojčaty a jeho oslabením s menším stupněm sdílených genů naznačuje silný genetický vliv na BMI. Tento závěr je však založen na předpokladu, že jednovaječná a sourozenecká dvojčata mají stejnou míru sdíleného prostředí – a to je předpoklad, který v praxi nemusí platit.

    Použití celogenomových asociačních studií k identifikaci genů souvisejících s obezitou

    Celogenomová asociační studie skenuje stovky tisíc genetických markerů napříč tisíci kompletními sadami DNA jednotlivců, aby nalezla genové variace, které mohou souviset s konkrétním onemocněním. Tyto studie mohou být použity k nalezení genových variací, které hrají roli v běžných, komplexních onemocněních, jako je obezita. Často změna pouze v jedné malé části DNA, která kóduje gen, může mít vliv na působení genu. Tyto drobné variace DNA, nazývané “genové varianty” nebo “jednonukleotidové polymorfismy” (SNP), často souvisí s rizikem onemocnění.

    V roce 2007 vědci pomocí celogenomových asociačních studií identifikovali první varianty genu související s obezitou v takzvaném genu “fat mass and obesity-associated” (FTO) genu na chromozomu 16. (4, 5) Tyto genové varianty jsou poměrně běžné a lidé, kteří ho mají, mají o 20 až 30 procent vyšší riziko obezity než lidé, kteří ho nemají. Druhá varianta genu spojená s obezitou, kterou vědci identifikovali, leží na chromozomu 18, v blízkosti genu receptoru melanokortinu-4 (stejný gen zodpovědný za vzácnou formu monogenní obezity). (6, 7)

    Dosud celogenomové asociační studie identifikovaly více než 30 kandidátních genů na 12 chromozomech, které jsou spojeny s indexem tělesné hmotnosti. (8󈝶) Je důležité mít na paměti, že i ten nejslibnější z těchto kandidátních genů, FTO, představuje pouze malý zlomek náchylnosti k obezitě související s genem. (11)

    Interakce mezi geny a prostředím: Proč dědičnost není osud

    Je nepravděpodobné, že by genetické změny vysvětlovaly rychlé šíření obezity po celém světě. (1) Je to proto, že četnost různých genů v celé populaci genu “ zůstává poměrně stabilní po mnoho generací. Trvá dlouho, než se nové mutace nebo polymorfismy rozšíří. Pokud tedy naše geny zůstaly z velké části stejné, co se změnilo za posledních 40 let rostoucí míry obezity? Naše prostředí: fyzické, sociální, politické a ekonomické prostředí, které ovlivňuje, kolik jíme a jak jsme aktivní. Změny životního prostředí, které lidem usnadňují přejídání a znesnadňují lidem dostatek fyzické aktivity, sehrály klíčovou roli při spouštění nedávného nárůstu nadváhy a obezity. (12)

    Práce na interakcích genů a prostředí souvisejících s obezitou jsou stále v plenkách. Dosavadní důkazy naznačují, že genetická predispozice není osudem – mnoho lidí, kteří jsou nositeli takzvaných “genů obezity”, netrpí nadváhou. Spíše se zdá, že zdravá strava a dostatek pohybu mohou působit proti určitému riziku obezity souvisejícímu s geny.

    V roce 2008 například Andreasen a kolegové prokázali, že fyzická aktivita kompenzuje účinky jednoho genu podporujícího obezitu, běžné varianty FTO. Studie provedená na 17 058 Dánech zjistila, že lidé, kteří byli nositeli genu podporujícího obezitu a byli neaktivní, měli vyšší BMI než lidé bez genové varianty, kteří byli neaktivní. Zdá se však, že u aktivních lidí na genetické predispozici k obezitě nezáleží: Jejich BMI nebylo vyšší ani nižší než u lidí, kteří gen pro obezitu neměli. (15)

    Následná práce o vztahu mezi genem FTO, fyzickou aktivitou a obezitou přinesla rozporuplné výsledky. (16󈝾) Aby se dospělo k definitivní odpovědi, výzkumníci nedávno spojili a znovu analyzovali data ze 45 studií u dospělých a 9 studií u dětí – celkem téměř 240 000 lidí. (19) Zjistili, že lidé, kteří měli variantu genu FTO podporující obezitu, měli o 23 procent vyšší riziko obezity než ti, kteří ji neměli. Ale opět, fyzická aktivita snížila riziko: Aktivní dospělí, kteří byli nositeli genu podporujícího obezitu, měli o 30 procent nižší riziko obezity než neaktivní dospělí, kteří tento gen měli.

    Většina lidí má pravděpodobně nějakou genetickou predispozici k obezitě v závislosti na jejich rodinné anamnéze a etnickém původu. Přechod od genetické predispozice k samotné obezitě obecně vyžaduje určitou změnu ve stravě, životním stylu nebo jiných environmentálních faktorech. Některé z těchto změn zahrnují následující:

    • okamžitá dostupnost potravin ve všech hodinách dne a na místech, kde se potraviny dříve neprodávaly, jako jsou čerpací stanice, lékárny a obchody s kancelářskými potřebami
    • dramatický pokles fyzické aktivity během práce, domácích aktivit a volného času, zejména u dětí
    • zvýšený čas strávený sledováním televize, používáním počítače a prováděním jiných sedavých činností a
    • příliv vysoce zpracovaných potravin, rychlého občerstvení a nápojů slazených cukrem spolu s všudypřítomnými marketingovými kampaněmi, které je propagují.

    Sečteno a podtrženo: Zdravé prostředí a životní styl mohou čelit rizikům souvisejícím s geny

    Lepší pochopení genetických příspěvků k obezitě – zejména běžné obezity – a interakcí mezi geny a prostředím povede k lepšímu pochopení příčinných cest, které vedou k obezitě. Takové informace by jednoho dne mohly přinést slibné strategie prevence a léčby obezity. Je však důležité si uvědomit, že celkově je příspěvek genů k riziku obezity malý, zatímco příspěvek našeho toxického prostředí pro potraviny a aktivity je obrovský. Jak napsal jeden vědec, “Geny mohou spolurozhodovat o tom, kdo se stane obézním, ale naše prostředí určuje, kolik z nich se stane obézních.” (20) Proto se úsilí o prevenci obezity musí zaměřit na změnu našeho prostředí, aby bylo zdravé rozhodování jednodušší. , pro všechny.

    Reference

    1. Hu F. Genetické prediktory obezity. In: Hu F, ed. Epidemiologie obezity. New York City: Oxford University Press, 2008 437-460.

    2. Farooqi S, O’Rahilly S. Genetika obezity u lidí. Endocr Rev. 2006 27:710-18.

    3. Maes HH, Neale MC, Eaves LJ. Genetické a environmentální faktory v relativní tělesné hmotnosti a lidské adipozitě. Chovej se Genet. 1997 27:325-51.

    4. Dina C, Meyre D, Gallina S, a kol. Variace v FTO přispívá k dětské obezitě a těžké obezitě dospělých. Nat Genet. 2007 39:724-6.

    5. Frayling TM, Timpson NJ, Weedon MN, et al. Běžná varianta v genu FTO je spojena s indexem tělesné hmotnosti a predisponuje k dětské a dospělé obezitě. Věda. 2007 316:889-94.

    6. Loos RJ, Lindgren CM, Li S, a kol. Běžné varianty poblíž MC4R jsou spojeny s tukovou hmotou, hmotností a rizikem obezity. Nat Genet. 2008 40:768-75.

    7. Qi L, Kraft P, Hunter DJ, Hu FB. Běžná varianta obezity v blízkosti genu MC4R je spojena s vyšším příjmem celkové energie a tuku ve stravě, změnou hmotnosti a rizikem diabetu u žen. Hum Mol Genet. 2008 17:3502-8.

    8. O’Rahilly S. Lidská genetika osvětluje cesty k metabolickým onemocněním. Příroda. 2009 462:307-14.

    9. Speliotes EK, Willer CJ, Berndt SI, et al. Asociační analýzy 249 796 jedinců odhalily osmnáct nových lokusů spojených s indexem tělesné hmotnosti. Nat Genet. 2010 42:937-48.

    10. Heid IM, Jackson AU, Randall JC. Metaanalýza identifikuje 13 nových lokusů spojených s poměrem pasu a boků a odhaluje sexuální dimorfismus v genetickém základu distribuce tuku. Nat Genet. 2010 42:949-60.

    11. Walley AJ, Asher JE, Froguel P. Genetický příspěvek k nesyndromové lidské obezitě. Nat Rev Genet. 2009 10:431-42.

    12. Qi L, Cho YA. Interakce mezi geny a prostředím a obezita. Nutr Rev. 2008 66:684-94.

    15. Andreasen CH, Stender-Petersen KL, Mogensen MS, et al. Nízká fyzická aktivita zvýrazňuje účinek polymorfismu FTO rs9939609 na akumulaci tělesného tuku. Diabetes. 2008 57:95-101.

    16. Rampersaud E, Mitchell BD, Pollin TI a kol. Fyzická aktivita a asociace běžných variant genu FTO s indexem tělesné hmotnosti a obezitou. Arch Intern Med. 2008 168:1791-7.

    17. Ruiz JR, Labayen I, Ortega FB a kol. Útlum účinku polymorfismu FTO rs9939609 na celkový a centrální tělesný tuk fyzickou aktivitou u adolescentů: studie HELENA. Arch Pediatr Adolesc Med. 2010 164:328-33.

    18. Jonsson A, Renstrom F, Lyssenko V, a kol. Hodnocení vlivu interakce mezi variantou FTO (rs9939609) a fyzickou aktivitou na obezitu u 15 925 švédských a 2 511 finských dospělých. Diabetologie. 2009 52:1334-8.

    19. KilpelinenTO, Qi L, Brage S, et al. Fyzická aktivita zmírňuje vliv variant FTO na riziko obezity: metaanalýza 218 166 dospělých a 19 268 dětí. PLoS Med. 20118:e1001116. Epub 2011, 1. listopadu.

    20. Veerman JL. O marnosti screeningu genů, po kterých se tloustne. PLoS Med. 2011 Nov8(11):e1001114. Epub 2011, 1. listopadu.

    21. Qi, Q, Chu, AY, Kang, JH, Huang, J, Rose, LM, Jensen, MK, Liang, L, Curhan, GC, Pasquale, LR, Wiggs, JL, De Vivo, I, Chan, AT , Choi, HK, Tamimi, RM, Ridker, PM, Hunter, DJ, Willett, WC, Rimm, EB, Chasman, DI, Hu, FB, Qi, L. (2014). Spotřeba smaženého jídla, genetické riziko a index tělesné hmotnosti: analýza interakce gen-dieta ve třech kohortových studiích v USA. BMJ 19348:g1610.

    22. Asai M Ramachandrappa S Joachim M Shen Y Zhang R Nuthalapati N Ramanathan V Strochlic, DE Ferket P Linhart K, Ho C Novoselova, TV Garg S Ridderstr


    Důležité otázky pro biotechnologické aplikace CBSE třídy 12 v zemědělství a medicíně

    1. Biotechnologie se v podstatě zabývá výrobou biofarmaceutik a biologických látek v průmyslovém měřítku. Mezi aplikace biotechnologie patří terapeutika, diagnostika, geneticky modifikované plodiny pro zemědělství, zpracované potraviny, bioremediace, zpracování odpadů a výroba energie.

    2. Biotechnologie má tyto tři kritické oblasti výzkumu:
    (i) Poskytnout nejlepší katalyzátor ve formě vylepšeného organismu, obvykle mikroba nebo čistého enzymu.
    (ii) Vytvořit optimální podmínky prostřednictvím inženýrství pro působení katalyzátoru.
    (iii) Technologie následného zpracování pro čištění proteinu/organické sloučeniny.

    3. Biotechnologické aplikace v zemědělství
    i) Biotechnologické aplikace v zemědělství zahrnují tyto tři možnosti:

    • Zemědělství založené na agrochemii.
    • Ekologické zemědělství.
    • Zemědělství založené na genetickém inženýrství.

    (ii) Zelená revoluce zvýšila produkci potravin díky použití:

    • Vylepšené odrůdy plodin.
    • Agrochemikálie (hnojiva a pesticidy).
    • Lepší postupy řízení.

    (iii) Geneticky modifikované organismy (GMO) jsou rostliny, zvířata, bakterie a houby, jejichž geny byly pozměněny manipulací.
    (iv) Genetická modifikace rostlin vedla k následujícímu:

    • Plodiny se stal tolerantnějším k abiotickým stresům, jako je chlad, sucho, sůl, teplo atd.
    • Snížená závislost na chemických pesticidech, tedy plodiny odolné vůči škůdcům.
    • Ztráty po sklizni sníženy.
    • V rostlinách se zvýšila efektivita využití minerálních látek (zabraňuje ztrátě úrodnosti půdy).
    • Zvyšuje se nutriční hodnota potravin, např. rýže obohacená vitaminem A.
    • Rostliny šité na míru jsou vytvářeny pomocí GM rostlin k dodávání alternativních zdrojů do průmyslu, ve formě škrobů, paliv a léčiv.
    • (v) Některé z aplikací biotechnologie v zemědělství jsou produkce rostlin odolných vůči škůdcům, které snižují množství používaných pesticidů.
      Bt toxin je produkován bakterií a exprimován v rostlinách, aby zajistil odolnost vůči hmyzu, ve skutečnosti vytvořil biopesticid, např. Bt bavlna, Bt kukuřice, zlatá rýže, rajčata, brambory a sójové boby atd.
    • Bt bavlna je vytvořena použitím některých kmenů bakterie Bacillus thuringiensis (Bt je krátká forma).
    • Tato bakterie produkuje proteiny, které zabíjejí určitý hmyz, jako jsou Lepidopterani (tabák, červci a červci), Coleopterani (brouci) a dvoukřídlí (mouchy a komáři).
    • thuringiensis tvoří proteinové krystaly během určité fáze svého růstu. Tyto krystaly obsahují toxický insekticidní protein.
    • Protein Bt toxinu existuje jako neaktivní protoxiny, ale jakmile hmyz pozře neaktivní toxin, přemění se na aktivní formu toxinu díky alkalickému pH střeva, které rozpouští krystaly.
    • Aktivovaný toxin se váže na povrch epiteliálních buněk středního střeva a vytváří póry, které způsobují otok buněk a lýzu vedoucí ke smrti hmyzu.
    • Specifické geny Bt toxinu byly izolovány z Bacillus thuringiensis a začleněny do několika plodin, jako je bavlna.
    • Většina Bt toxinů je specifická pro skupinu hmyzu. Toxin je kódován genem zvaným cry, g. proteiny kódované geny křičí IAc a křičí IIAb kontrolují chřipky bavlníkové a brečí IAb kontrolují zavíječe kukuřičného.

    (vi) Rostliny odolné vůči škůdcům jsou vyvinuty pomocí biotechnologických procesů.

    • Nematoda Meloidogyne incognita infikuje kořeny rostlin tabáku, což snižuje produkci tabáku.
    • Proces RNA interference (RNAi) se používá pro buněčnou obranu. Zahrnuje umlčení specifické mRNA díky komplementární dsRNA. Vyskytuje se ve všech eukaryotických organismech jako metoda buněčné obrany.
    • dsRNA se váže a zabraňuje translaci mRNA (umlčení).
    • Zdroj této komplementární RNA by mohl pocházet z infekce viry s RNA genomy nebo mobilními genetickými elementy (transpozony), které se replikují přes RNA meziprodukt.
    • Agrobacteriumvectors se používají k zavedení genů specifických pro nematody do hostitelské rostliny. V hostitelských buňkách produkuje jak sense, tak anti-sense RNA.
    • Tyto dvě RNA jsou vzájemně komplementární a tvoří dvouvláknovou RNA (rfsRNA), která iniciuje RNAi, a tím umlčí specifickou mRNA hlístice.
    • Parazit nemůže přežít v transgenním hostiteli exprimujícím specifickou interferující RNA. Transgenní rostlina je tak chráněna před parazitem.

    4. Biotechnologické aplikace v medicíně měly obrovský dopad v oblasti zdravotnictví tím, že umožnily masovou výrobu bezpečných a účinnějších terapeutických léků.

    • Rekombinantní terapeutika neindukují nežádoucí imunologické reakce jako v případě podobných produktů izolovaných z jiných než lidských zdrojů.
    • V současné době je po celém světě schváleno pro použití u lidí asi 30 rekombinantních léčiv. V Indii se v současnosti uvádí na trh 12 z nich.

    I. Geneticky upravený inzulín vede k dostatečné dostupnosti inzulinu pro léčbu diabetu v dospělosti.
    a) Inzulin používaný při cukrovce byl dříve extrahován ze slinivky břišní poraženého skotu a prasat. To u některých pacientů způsobilo alergické nebo jiné reakce.
    (b) Inzulin se skládá ze dvou krátkých polypeptidových řetězců, tj. řetězce-A a B, spojených dohromady disulfidickými můstky.

    c) U savců je inzulin syntetizován jako prohormon (je třeba jej zpracovat, než se stane plně zralým a funkčním hormonem), který obsahuje další úsek nazývaný C-peptid.
    (d) C-peptid není přítomen ve zralém inzulínu $nd je odstraněn během zrání na inzulín. Hlavní výzvou pro produkci inzulínu pomocí technik rDNA tedy bylo dostat inzulín do zralé formy.
    (E) Eli Lilly americká společnost v roce 1983 připravila dvě sekvence DNA odpovídající řetězcům A a B lidského inzulínu a zavedla je do plazmidů E. coli, aby vytvořily inzulínové řetězce. Řetězce-A a B byly vyrobeny odděleně, extrahovány a kombinovány vytvořením disulfidických vazeb za vzniku lidského inzulínu.
    II. Výroba vakcín pomocí genetického inženýrství takové vakcíny se nazývají rekombinantní vakcíny také nazývané „podjednotkové vakcíny“ nebo „vakcíny druhé generace“, např. hepatitida-B. Jedná se o dva typy:
    (A) Proteinové vakcíny použití specifického proteinu produkovaného rDNA ve vakcíně.
    (b) DNA vakcíny používají geneticky upravenou DNA, která má být injikována jako vakcína k vyvolání imunologické odpovědi.
    Vakcína proti hepatitidě obsahuje virový obalový protein, povrchový antigen hepatitidy B (HB8 Ag). Tento gen je izolován z kvasinkových vektorů.
    Některé geny kódující proteiny izolované z patogenů jsou také inkorporovány a exprimovány v rostlinách produkujících antigeny a nazývají se také jedlé vakcíny.
    III. Genová terapie je soubor metod, které umožňují korekci genových defektů, diagnostikovaných u dítěte nebo embrya.
    (a) Geny se vkládají do buněk a tkání člověka za účelem léčby nemoci.
    (b) Korekce genetického defektu zahrnuje dodání normálního genu do jedince nebo embrya, aby převzal funkci a kompenzoval nefunkční gen.
    c) První genová terapie byla podána čtyřleté dívce s deficitem adenosindeaminázy (ADA) M Blease a WF Andresco v 90. letech 20. století

    • ADA je způsobena delecí genu pro adenosindeaminázu.<
      U některých dětí lze nedostatek ADA vyléčit transplantací kostní dřeně a enzymatickou substituční terapií, ale nejsou zcela vyléčitelné.
      (d) Zapojené kroky jsou následující:
    • V prvním kroku genové terapie se lymfocyty z krve pacienta pěstují v kultuře mimo tělo.
    • Do těchto lymfocytů je poté zavedena funkční cDNA ADA (pomocí retrovirového vektoru), které jsou následně vráceny pacientovi.
    • Protože tyto buňky nejsou nesmrtelné, pacient vyžaduje periodickou infuzi takto geneticky upravených lymfocytů.
    • Pokud je gen izolovaný z buněk kostní dřeně produkující ADA zaveden do buněk v raných embryonálních stádiích, mohlo by to být trvalé vyléčení.
    • Některé další nemoci, které lze léčit genovou terapií, jsou hemofilie, cystická fibróza, Parkinsonova choroba atd.

    (IV) Molekulární diagnostika pomáhá řešit problém včasné diagnostiky a léčby nemocí.
    a) Při použití konvenčních diagnostických metod (analýza séra a moči) není možné včasné zjištění onemocnění.
    (b) K překonání tohoto problému byly vyvinuty některé techniky molekulární diagnostiky, které umožňují včasnou detekci nemocí. Jedná se o následující:
    (i) Polymerázová řetězová reakce (PCR) pomáhá při včasné detekci nemocí nebo patogenů amplifikací jejich nukleové kyseliny.
    Nízká koncentrace patogenů (bakterie, viry atd.) v krvi neumožňuje její detekci.
    PCR může amplifikovat nukleové kyseliny takových patogenů, i když je jejich koncentrace velmi nízká.
    Technika PCR může být použita pro detekci HIV u pacientů s podezřením na AIDS, genetické mutace u pacientů s podezřením na rakovinu a při identifikaci genetických poruch.
    (ii) Technologie rekombinantní DNA je moderní molekulární diagnostická technika. Provádí se v následujících krocích:
    Jednořetězcová DNA nebo RNA značená radioaktivní molekulou zvanou sonda se nechá hybridizovat se svou komplementární DNA v klonu buněk.
    Buňky jsou pak detekovány autoradiografií.
    Klon s mutovaným genem se neobjeví na fotografickém filmu, protože sonda nebude mít komplementaritu s mutovaným genem.
    (iii) Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) je založena na principu interakce antigen-protilátka. Infekce patogenem může být detekována přítomností antigenů (proteiny, glykoproteiny atd.) nebo detekcí protilátek syntetizovaných proti patogenu.
    Otázky ke zkoušce z předchozích ročníků
    1 Označte otázky
    1. Uveďte roli C-peptidu v lidském inzulínu. [Celá Indie 2014]
    Ans. C-peptid je další úsek peptidů, který spojuje A a B-polypeptidové řetězce inzulínu v prohormonu. Během zpracování k uvolnění zralého a funkčního inzulínu je tento C-peptid odstraněn

    2. Chlapci byl diagnostikován nedostatek ADA (adenosindeaminázy). Navrhněte jakoukoli možnou léčbu. [Dillí 2014C]
    Ans. Chlapec s diagnostikovaným deficitem ADA může podstoupit léčbu genovou terapií, ale nejde o trvalé vyléčení.

    3. Napište možný zdroj genu RNA interference (RNAi). [Dillí 2013c]
    Ans. Mobilní genetické elementy, tedy transpozony, jsou možným zdrojem genu RNA interference (RNAi).

    4. Jmenujte libovolné dvě techniky, které slouží k včasné diagnostice některých bakteriálních/virových lidských onemocnění. [Zahraničí 2011]
    nebo
    Jmenujte molekulární diagnostickou techniku ​​pro detekci přítomnosti patogenu v jeho raném stádiu infekce. [Dillí 2010 Celá Indie 2008]
    Ans. Techniky, které slouží k včasné diagnostice některých bakteriálních/virových lidských onemocnění.
    (i) Polymerázová řetězová reakce (PCR).
    (ii) DNA rekombinantní technologie a
    (iii) ELISA jsou techniky pro včasnou diagnostiku bakteriálních/virových onemocnění

    5. Jak se ds RNA dostane do eukaryotické buňky, aby způsobila interferenci RNA? [Dillí 2011c]
    Ans. dsRNA získává vstup do eukaryotické buňky buď prostřednictvím:
    (i) infekce virem s genomem RNA nebo
    (ii) mobilní genetické elementy (transpozony), které se replikují prostřednictvím meziproduktu RNA.

    6. Jmenujte zdrojový organismus genu cry IAc a jeho cílového škůdce. [Zahraničí 2011]
    Ans. Zdrojem genu crylAc je Bacillus thuringiensis a jeho cíloví škůdci – bavlníkové.

    7. Jak se nazývá hostitel, který produkuje cizí genový produkt? Jak se tento produkt jmenuje? [Zahraničí 2010]
    Ans. Transgenní organismy nebo geneticky modifikované organismy jsou hostitelé, kteří produkují cizí genový produkt.
    Produktem jsou rekombinantní proteiny.

    8. Pojmenujte geny pláče, které kontrolují můru bavlníkovou a vrtuli komouškovou. [Celá Indie 2009c]
    Ans. Plačící geny, které ovládají Cotton bolt worm – cry lAc a cry llAb Zavíječ kukuřičný-cry lAb

    9. Jaký význam má proces RNA interference (RNAi) v eukaryotických organismech? [Zahraničí 2008]
    Ans. RNA interference (RNAi) působí jako buněčná obrana ve všech eukaryotických organismech

    10. Uveďte princip, na kterém ELISA funguje. [Zahraničí 2008]
    Ans. ELISA je založena na principu interakce antigen-protilátka.

    11. Jak umlčení specifické mRNA v RNA interferenci zabraňuje parazitární infekci? [Dillí 2008C]
    Ans. Parazitární infekci lze předejít použitím procesu RNA interference (RNAi), protože hlístice nemohou žít v transgenním hostiteli, který exprimuje specifickou interferující RNA, takže je dvouvláknová a není schopna překládat protein nebo produkt.

    12. Jaký užitek mají rostliny tabáku, když se do nich pomocí určitých vektorů vnesou geny specifické pro nematody? Pojmenujte použité vektory. [Dillí 2008C]
    Ans. Geny specifické pro hlístice, když jsou zavedeny do hostitelských rostlin, iniciují proces RNAi a tím umlčují specifickou mRNA hlístic. Parazit nemůže přežít v transgenním hostiteli, proto zabraňte rostlinám před škůdci. Použitý vektor je Agrobacterium.

    Otázky se 2 body

    13. Uveďte, jak bylo vyrobeno Agrobacterium tumefaciens jako užitečný klonovací vektor pro přenos DNA do rostlinných buněk. [Dillí 2014]
    Ans. O bakterii Agrobacterium tumefaciens je známo, že je přirozeným vektorem schopným předat svou DNA rostlinám a indukovat nádor integrací své DNA do hostitelského genomu. Gen způsobující nádor v plazmidu této bakterie je nahrazen požadovaným genem a nyní se používá jako klonovací vektor pro přenos DNA do rostlinných buněk.

    14. Co je genová terapie? Uveďte první klinický případ, kdy byl použit. [Dillí 2014]
    Ans. Genová terapie je korektivní terapie nebo technika genetického inženýrství k nahrazení vadného nebo nefunkčního genu normálním zdravým funkčním genem,
    První klinická genová terapie byla podána 4leté dívce s deficitem ADA (adenosindeaminázy) v roce 1900 kvůli deleci genu kódujícího ADA.

    15. Proč Bt toxin nezabíjí bakterii, která jej produkuje, ale zabíjí hmyz, který jej pozře? [Dillí 2014]
    nebo
    Proč toxické insekticidní proteiny vylučované Bacillus thuringiensis zabíjejí hmyz a ne bakterie samotné? [Zahraničí 2010]
    Ans. Bt toxin nezabíjí bakterie, protože existuje jako neaktivní protoxin.
    Když je Bt toxin pozřen hmyzem, přemění se na svou aktivní formu díky alkalickému pH střeva. Aktivovaný toxin se váže na povrch epiteliálních buněk středního střeva a vytváří póry. Vniklá voda způsobuje otoky a lýzu buněk v těle hmyzu.

    16. Vysvětlete, jak americká společnost Eli Lilly vyráběla inzulin technologií rekombinantní DNA.
    [Zahraničí 2014]
    Ans. Výroba inzulínu společností Eli Lilly
    (i) DNA sekvence odpovídající dvěma polypeptidovým, A a B-řetězcům inzulínu, jsou syntetizovány in vitro.
    (ii) Jsou zavedeny do plazmidové DNA E. coli.
    (iii) Tato bakterie je klonována za vhodných podmínek.
    (iv) Transgen je exprimován ve formě polypeptidů A a B sekretovaných do média.
    (v) Jsou extrahovány a kombinovány vytvořením disulfidického můstku za vzniku lidského inzulínu.

    17. Co kódují geny ‘cry’ v Bacillus thuringiensis? Uveďte jeho význam pro pěstování bavlny. [Celá Indie 2014C]
    Ans. ‘cry geny’ v Bacillus thuringiensis kóduje toxické insekticidní proteiny, které existují jako neaktivní prototoxiny.
    Tyto proteiny, když jsou exprimovány v bavlníkových plodinách pomocí genetického inženýrství, propůjčují škůdcům odolnost proti bavlníkovi a zabraňují poškození. Když se larvy tohoto hmyzu živí částmi rostlin bavlníku, toxin se aktivuje v jejich střevech, lyžuje jejich buňky a vede k smrti, čímž je činí odolnými vůči škůdcům.

    18. Když je lidský inzulín syntetizován v těle, musí být zpracován, než může působit. Vysvětlete a uveďte důvody. [Dillí 2014c]
    Ans. Lidský inzulín, když je zpočátku syntetizován v lidském těle, sestává ze tří peptidových řetězců - A, B a C. C-peptid je další úsek aminokyselin spojující A a B-řetězce. To se nazývá proinzulin nebo prohormon. Prochází zpracováním nebo sestřihem, aby se uvolnil funkční zralý inzulín, který může vykonávat své normální funkce. Během zpracování je C-peptid odstraněn. Pouze A a B-řetězce přispívají k tvorbě funkčního inzulínu.

    19. Napište nějaké dva způsoby, jak jsou geneticky modifikované rostliny shledány užitečnými? [Celá Indie 2014C]
    Ans. Pak se zjistí, že geneticky modifikované rostliny jsou užitečné, protože:
    i) omezit nebo minimalizovat používání chemikálií, hnojiv, insekticidů, herbicidů atd.
    ii) snížit posklizňové ztráty a zvýšit nutriční hodnotu plodiny.

    20. Pojmenujte onemocnění, které jako první dostalo léčbu genovou terapií. Napište příčinu onemocnění a vliv, který má na pacienta. [Dillí 2014C]
    Ans. Onemocnění z nedostatku ADA (adenosindeaminázy) bylo první, kdo dostal léčbu genovou terapií.
    Onemocnění je způsobeno delecí genu, který kóduje enzym adenindeaminázu (ADA). Nedostatek enzymu ADA ovlivňuje fungování imunitního systému.

    21. Proč se proinzulin tak nazývá? Jak se od něj inzulín liší? [Celá Indie 2013]
    Ans. Proinzulin obsahuje extra úsek zvaný C-peptid, který je třeba odstranit, aby se stal plně zralým inzulinem, proto se nazývá proinzulin (prohormon). Zralý funkční inzulín obsahuje pouze A a B-peptidový řetězec

    22. (i) Uveďte úlohu DNA ligázy v biotechnologii.
    (ii) Co se stane, když Meloidogyne incognita konzumuje buňky s genem RNAi? [Dillí 2012]
    Ans. (i) Enzym DNA ligáza se používá ke spojení dvou fragmentů DNA z jejich konců.
    (ii) Když Meloidogyne incognita (parazit) konzumuje buňky s genem RNAi, parazit nemůže přežít a to zabraňuje infekci. Zavedená DNA tvoří jak sense, tak anti-sense RNA. Tyto dva řetězce jsou vzájemně komplementární formou sRNA, což vede k RNAi. Tím je mRNA hlístic umlčena a parazit zde nemůže přežít. To produkuje rostliny tabáku odolné proti Meloidogyne incognita.

    23. (i) Uveďte příčinu a tělesný systém postižený nedostatkem ADA u lidí.
    (ii) Pojmenujte vektor použitý pro přenos ADA-DNA do recipientních buněk u lidí. Pojmenujte buňky příjemce. [Celá Indie 2012]
    Ans. (i) ADA je způsobena delecí genu pro adenosindeaminázu. V důsledku toho je ovlivněn imunitní systém těla.
    (ii) Retrovirový vektor se používá k přenosu ADA-DNA do recipientních buněk člověka.
    Recipientní buňky-lymfocyty.

    24. Vysvětlete, jak lze napravit dědičné onemocnění. Uveďte příklad prvního úspěšného pokusu o nápravu takového onemocnění? [Dillí 2011]
    nebo
    Jak se genová terapie používá při léčbě pacientů s deficitem ADA? [Celá Indie 2008C]
    Ans. Dědičné onemocnění lze upravit genovou terapií. Jde o soubor metod, které umožňují korekci nebo náhradu defektního genu. První genová terapie byla podána v roce 1990 4leté dívce s deficitem adenosindeaminázy (ADA). Je způsobena delecí genu pro adenosindeaminázu.
    Léčba zahrnuje následující kroky:
    (i) Lymfocyty z krve pacienta jsou pěstovány na kultuře mimo tělo.
    (ii) Funkční ADA, cDNA (s použitím retrovirového vektoru) je pak zavedena do těchto lymfocytů.
    (iii) Takové geneticky upravené lymfocyty jsou vráceny do krve pacienta.
    (iv) Pacient vyžaduje pravidelnou infuzi takového geneticky upraveného lymfocytu.

    25. Jak pomáhá technologie rekombinantní DNA při detekci přítomnosti mutantního genu u pacientů s rakovinou? [Celá Indie 2011c]
    Ans. Jednořetězcová DNA nebo RNA, značená radioaktivní molekulou (sondou), se nechá hybridizovat se svou komplementární DNA v klonu buněk a následuje detekce pomocí autoradiografie.
    Klon s mutovaným genem se neobjeví na fotografickém filmu, protože sonda nebude komplementární s mutovaným genem, což je užitečné při detekci přítomnosti mutovaného genu u pacientů s rakovinou.

    26. Vysvětlete proces RNA interference. [Dillí 2011]
    Ans. Proces RNA interference (RNAi) souvisí s umlčením specifické mRNA. Je to metoda buněčné obrany u všech eukaryot.
    (i) Komplementární RNA se váže na mRNA, čímž ji činí dvouvláknovou a brání její translaci.
    (ii) Tato komplementární RNA by mohla pocházet z infekce viry, které mají genomy RNA nebo mobilní genetické elementy (transpozony), které se replikují prostřednictvím meziproduktu RNA.
    (iii) Pomocí vektorů Agrobacterium byly do hostitelských rostlin zavedeny geny specifické pro nematody.
    (iv) V hostitelských buňkách produkuje jak sense, tak anti-sense RNA.
    (v) Tyto dvě RNA, které jsou vzájemně komplementární, tvoří dvouvláknovou RNA (dsRNA), která iniciovala RNAi a umlčela specifickou mRNA hlístice.
    (vii) Díky tomu nemohl parazit přežít v transgenním hostiteli exprimujícím interferující RNA. Transgenní rostlina je tedy chráněna.

    27. Proč není zavedení geneticky upravených lymfocytů u pacienta s deficitem ADA trvalým vyléčením? Navrhněte možné trvalé vyléčení. [Dillí 2010]
    Ans. Geneticky upravené lymfocyty mají životnost. Pacient tedy vyžaduje periodickou infuzi geneticky upravených lymfocytů, takže vyléčení není trvalé. Léčba může být trvalá, pokud je gen izolovaný z buněk kostní dřeně produkující ADA zaveden do buněk v časných embryonálních stádiích.

    28. Jak Eli Lilly syntetizovala lidský inzulín? Uveďte jeden rozdíl mezi tímto inzulinem a inzulinem produkovaným lidskou slinivkou. [Celá Indie 2010]
    Ans. (I) Výroba inzulínu společností Eli Lilly
    (i) DNA sekvence odpovídající dvěma polypeptidovým, A a B-řetězcům inzulínu, jsou syntetizovány in vitro.
    (ii) Jsou zavedeny do plazmidové DNA E. coli.
    (iii) Tato bakterie je klonována za vhodných podmínek.
    (iv) Transgen je exprimován ve formě polypeptidů A a B sekretovaných do média.
    (v) Jsou extrahovány a kombinovány vytvořením disulfidického můstku za vzniku lidského inzulínu.
    (II) Rozdíly mezi inzulínem produkovaným rDNA a inzulínem produkovaným slinivkou jsou:
    29.Jak se vyrábí Bt bavlna, aby dosáhla odolnosti proti červci? [Dillí 2010C]
    Ans. Bt toxinové geny cryI Ac a cryllAb kontrolují bavlníkové červy. Tyto geny jsou izolovány z bakterie a jsou začleněny do rostlin bavlníku.
    ‘cry geny’ v Bacillus thuringiensis kóduje toxické insekticidní proteiny, které existují jako neaktivní prototoxiny.
    Tyto proteiny, když jsou exprimovány v bavlníkových plodinách pomocí genetického inženýrství, propůjčují odolnost škůdcům proti bavlníkovi a brání poškození. Když se larvy tohoto hmyzu živí částmi rostlin bavlníku, toxin se aktivuje v jejich střevech, lyžuje jejich buňky a vede k smrti, čímž je činí odolnými vůči škůdcům.

    30. Zdůrazněte jakékoli čtyři výhody geneticky modifikovaných organismů (GMO). [Zahraniční 2009 Celá Indie 2008C]
    1. Výhody GMO jsou následující:
    (i) Tolerance vůči abiotickým stresům, jako je chlad, sucho, sůl, teplo.
    (ii) Snižuje závislost na chemických pesticidech.
    (iii) Snížení ztrát po sklizni.
    (iv) Zvýšit efektivitu využívání minerálů rostlinami. Výhody GMO jsou následující
    31. Uveďte tři molekulární diagnostické techniky, které pomáhají odhalit patogeny u podezřelých pacientů, Uveďte jednu výhodu těchto technik oproti konvenčním metodám. [Dillí 2009c]
    Ans. Molekulární diagnostické techniky pro patogeny jsou následující:
    (i) Polymerázová řetězová reakce (PCR).
    (ii) Technologie rekombinantní DNA.
    (iii) Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA).
    Výhodou těchto technik je, že napomáhají včasnému odhalení a léčbě onemocnění, což konvenční diagnostika neumožňuje.

    32. Rozbalte ELISA. Na jakém principu je test ELISA založen? Uveďte dva způsoby, jak lze infekci detekovat tímto testem. [Celá Indie 2009C]
    Ans. ELISA – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay.
    ELISA je založena na interakci antigen-protilátka.
    Dva způsoby, jak detekovat přítomnost infekce nebo onemocnění pomocí ELISA, jsou následující:
    (i) Detekuje se přítomnost antigenů (proteinů, glykoproteinů atd.).
    (ii) Jsou detekovány protilátky produkované proti patogenu.

    Otázky se 3 body

    33.Jak proces RNA interference pomohl zabránit tomu, aby háďátko infikovalo kořeny rostlin tabáku?
    Ans. Když nematoda infikuje kořeny rostlin tabáku a živí se buňkami obsahujícími gen RNAi. Tato DNA produkovala jak sense, tak anti-sense RNA v hostitelských buňkách (tabáková rostlina) a je komplementární k funkční mRNA háďátka. Tato komplementarita mezi oběma RNA ji činí dvouvláknovou, a tudíž umlčenou tím, že není přeložena do proteinu. Interference s expresí RNA a syntézou proteinů ztěžuje patogenům přežití v rostlinách tabáku, a tím i usmrcení. Tímto způsobem RNA interference chrání a kontroluje infekci háďátkem.

    34. Pojmenujte hostitelskou rostlinu a její část, kterou Meloidogyne incognita infikuje. Vysvětlete roli Agrobacterium v produkci dsRNA v hostitelské rostlině. [Dillí 2014C]
    Ans. Nematoda Meloidogyne incognita infikuje kořeny rostlin tabáku.
    Agrobacterium se používají jako vektory nesoucí geny specifické pro nematody, které mají být zavedeny do hostitelské rostliny. Tyto geny, když jsou exprimovány uvnitř hostitelské rostliny, produkují sense a anti-sense RNA vlákna, komplementární k funkční mRNA hlístic. Tato vazba má za následek tvorbu dvouřetězcové RNA a inhibici nebo umlčení translace specifikované RNA. Tento proces se nazývá interference RNA.

    35. Jmenuj škůdce, který ničí vatové tobolky. Vysvětlete roli Bacillus thuringiensis při ochraně plodiny bavlny proti škůdcům za účelem zvýšení výnosu. [Celá Indie 2013]
    nebo
    Jak vzniká závod Btcotton jako GM závod? Jak je chráněna proti napadení tobolkou? [Dillí 2013C]
    Ans. Škůdci, kteří ničí vatové smotky, jsou červci bavlníkové a zavíječ bavlníkový. Bt bavlna se vyrábí pomocí některých kmenů bakterie Bacillus thuringiensis (krátká forma Btis).
    (i) Tato bakterie produkuje bílkoviny, které zabíjejí určitý hmyz, jako jsou Lepidopterani (háďátka tabáková a armádní červ), Coleopterani (brouci) a dvoukřídlí (mouchy a komáři).
    (ii) Bacillus thuringiensis tvoří proteinové krystaly během určité fáze svého růstu. Tyto krystaly obsahují toxický insekticidní protein.
    (iii) Protein toxinu Bt existuje jako neaktivní prototoxiny, ale jakmile hmyz pozře neaktivní toxin, přemění se na aktivní formu díky alkalickému pH střeva, které rozpouští krystaly.
    (iv) Aktivovaný toxin se váže na povrch epiteliálních buněk středního střeva a vytváří póry, které způsobují otok buněk a lýzu vedoucí ke smrti hmyzu.
    (v) Specifické geny Bttoxinu byly izolovány z Bacillus thuringiensis a začleněny do několika plodin.
    (vi) Většina Bttoxinů je specifická pro skupinu hmyzu. Proto je toxin kódován genem zvaným cry. Například proteiny kódované geny cry I Ac a cry lAb kontrolují bavlníkové tobolky a cry lAb kontrolují zavíječe kukuřičného.

    36. Vyjmenujte geny zodpovědné za to, že rostliny Bt bavlny jsou odolné vůči napadení hlísty Jak takové rostliny dosáhnou odolnosti proti napadení hlísty. Vysvětlit. [Dillí 2012]
    Ans. Geny cry IAc a cryIIAb kontrolují vatu.
    ‘cry geny’ v Bacillus thuringiensis kóduje toxické insekticidní proteiny, které existují jako neaktivní prototoxiny.
    Tyto proteiny, když jsou exprimovány v bavlníkových plodinách pomocí genetického inženýrství, propůjčují odolnost škůdcům proti bavlníkovi a brání poškození. Když se larvy tohoto hmyzu živí částmi rostlin bavlníku, toxin se aktivuje v jejich střevech, lyžuje jejich buňky a vede k smrti, čímž je činí odolnými vůči škůdcům.

    37. i) Rostliny tabáku jsou vážně poškozeny napadením Meloidogyne incognita. Pojmenujte a vysvětlete strategii, která byla přijata k zastavení tohoto zamoření,
    (ii) Pojmenujte vektor použitý pro zavedení genu specifického pro háďátko do rostliny tabáku. [Celá Indie 2012]
    nebo
    Jak pomáhá interference RNA při rozvoji rezistence u infekce háďátkem agamstem u tabákových rostlin? [Dillí 2010]
    Ans. (i) Zamoření tabákové rostliny lze zastavit použitím RNA interference
    (RNAi) proces.
    Proces RNAi
    Proces RNA interference (RNAi) souvisí s umlčením specifické mRNA. Je to metoda buněčné obrany u všech eukaryot.
    (i) Komplementární RNA se váže na mRNA, čímž ji činí dvouvláknovou a brání její translaci.
    (ii) Tato komplementární RNA by mohla pocházet z infekce viry, které mají genomy RNA nebo mobilní genetické elementy (transpozony), které se replikují prostřednictvím meziproduktu RNA.
    (iii) Pomocí vektorů Agrobacterium byly do hostitelských rostlin zavedeny geny specifické pro nematody.
    (iv) V hostitelských buňkách produkuje jak sense, tak anti-sense RNA.
    (v) Tyto dvě RNA, které jsou vzájemně komplementární, tvoří dvouvláknovou RNA (dsRNA), která iniciovala RNAi a umlčela specifickou mRNA hlístice.
    (vii) Díky tomu nemohl parazit přežít v transgenním hostiteli exprimujícím interferující RNA. Transgenní rostlina je tedy chráněna.
    (ii) Vektor použitý pro zavedení genu specifického pro nematoda do rostliny tabáku
    je Agrobacterium.

    38. Jak biotechnologie pomohla při produkci Meloidogyne incognita rezistentní tabákové rostliny?
    (ii) Proč tato hlístice zemře při konzumaci takové GM rostliny? [Dillí 2010C]
    Ans. (i) Když Meloidogyne incognita (parazit) konzumuje buňky s genem RNAi, parazit nemůže přežít a to zabraňuje infekci. Zavedená DNA tvoří jak sense, tak anti-sense RNA. Tyto dva řetězce jsou vzájemně komplementární formou sRNA, což vede k RNAi. Tím je mRNA hlístic umlčena a parazit zde nemůže přežít. To produkuje rostliny tabáku odolné proti Meloidogyne incognita.
    (ii) V důsledku procesu RNAi je specifická mRNA hlístic umlčena. Výsledkem je, že parazit nemohl přežít při konzumaci takové GM nebo transgenní rostliny (hostitele), exprimující specifickou interferující RNA

    39. Vysvětlete účinek delece genu pro ADA u jedince.
    (ii) Jak v tomto případě pomáhá genová terapie? [Celá Indie 2010c]
    Ans. (i) Delece genu pro ADA u jedince vede k poruše nedostatku ADA. Enzym adenosindeamináza (ADA) je zásadní pro fungování imunitního systému.
    (ii) Genová terapie je užitečná v případě nedostatku ADA.
    Dědičné onemocnění lze upravit genovou terapií. Jde o soubor metod, které umožňují korekci nebo náhradu defektního genu. První genová terapie byla podána v roce 1990 4leté dívce s deficitem adenosindeaminázy (ADA). Je způsobena delecí genu pro adenosindeaminázu.
    Léčba zahrnuje následující kroky:
    (i) Lymfocyty z krve pacienta jsou pěstovány na kultuře mimo tělo.
    (ii) Funkční ADA, cDNA (s použitím retrovirového vektoru) je pak zavedena do těchto lymfocytů.
    (iii) Takové geneticky upravené lymfocyty jsou vráceny do krve pacienta.
    (iv) Pacient vyžaduje pravidelnou infuzi takového geneticky upraveného lymfocytu.

    40. Plazmid je přínosem pro biotechnologii. Toto tvrzení odůvodněte uvedením produkce lidského inzulínu jako příkladu. [Celá Indie 2009]
    Ans. Plazmid je autonomně se replikující extrachromozomální kruhová DNA nalezená v bakteriálních buňkách. Protože se může replikovat v bakteriální buňce, používá se jako vektor v technologii rDNA.
    Produkce inzulínových polypeptidových řetězců odděleně plasmidy E. coli umožnila umělou produkci zralého lidského inzulínu.
    (I) Výroba inzulínu společností Eli Lilly
    (i) DNA sekvence odpovídající dvěma polypeptidovým, A a B-řetězcům inzulínu, jsou syntetizovány in vitro.
    (ii) Jsou zavedeny do plazmidové DNA E. coli.
    (iii) Tato bakterie je klonována za vhodných podmínek.
    (iv) Transgen je exprimován ve formě polypeptidů A a B sekretovaných do média.
    (v) Jsou extrahovány a kombinovány vytvořením disulfidického můstku za vzniku lidského inzulínu.
    Rozdíly mezi inzulínem produkovaným rDNA a inzulínem produkovaným slinivkou jsou:
    41. Uveďte zdroj a typy cry genů, které byly z něj izolované pro začlenění do plodin biotechnology. Vysvětlete, jak tyto geny přinesly příznivé změny v geneticky modifikovaných plodinách. [Celá Indie 2009]
    Ans. Zdrojem je Bacillus thuringiensis.
    Typy crygenů pláč IAc, pláč IIAB, pláč lAb.
    Změny způsobené cry geny v GM plodinách:
    (i) Cry geny kódují určité krystalové proteiny, které mají Bt toxin.
    (ii) Bt toxin existuje jako neaktivní protoxin a přeměňuje se na aktivní formu (toxin) v alkalickém pH střeva hmyzu.
    (iii) Aktivovaný toxin se váže na epiteliální buňky lemující povrch středního střeva a vytváří póry vedoucí k otoku a lýze buněk a nakonec způsobí smrt hmyzu.
    (iv) Tímto způsobem vykazují GM plodiny odolnost vůči hmyzím škůdcům.

    42. Jak společnost Eli Lilly postupovala při přípravě lidského inzulínu? Jak se tedy inzulín produkovaný liší od toho, který produkuje funkční lidský inzulínový gen? [Zahraničí 2009]
    Ans.Výroba inzulínu společností Eli Lilly
    (i) DNA sekvence odpovídající dvěma polypeptidovým, A a B-řetězcům inzulínu, jsou syntetizovány in vitro.
    (ii) Jsou zavedeny do plazmidové DNA E. coli.
    (iii) Tato bakterie je klonována za vhodných podmínek.
    (iv) Transgen je exprimován ve formě polypeptidů A a B sekretovaných do média.
    (v) Jsou extrahovány a kombinovány vytvořením disulfidického můstku za vzniku lidského inzulínu.
    Rozdíly mezi inzulínem produkovaným rDNA a inzulínem produkovaným slinivkou jsou:
    43. Co jsou proteiny Cry? Pojmenujte organismus, který jej produkuje. Jak člověk využívá tento protein ve svůj prospěch? [Dillí 2009c]
    Ans. Kryprotein (krystalický protein) je toxin kódovaný genovým pláčem a je jedovatý pro některé druhy hmyzu. Zajistěte tak rostlinám odolnost proti hmyzu.
    Bacillus thuringiensis produkuje cry protein.
    Gen produkující protein Cry se přenese do rostliny, aby zajistil odolnost proti larvám hmyzu. Člověk vyvinul několik transgenních plodin zavedením těchto genů z bakterií do plodin, jako je Bt bavlna, Bt kukuřice atd.

    Otázky s 5 body

    44. Uveďte zdroj, ze kterého byl inzulín dříve extrahován. Proč tento inzulín již nepoužívají diabetici?
    (ii) Vysvětlete proces syntézy inzulínu společností EH Lilly. Pojmenujte techniku, kterou společnost používá.
    (iii) Jak se liší inzulín produkovaný lidským tělem od inzulínu vyráběného výše uvedenou společností? [Celá Indie 2011]
    nebo
    (i) Jak se zralý inzulín liší od proinzulínu vylučovaného slinivkou u člověka?
    (ii) Vysvětlete, jak byl vyroben lidský funkční insuhn pomocí technologie rDNA.
    (iii) Proč je takto produkovaný funkční inzulín považován za lepší než ten, který dříve užívali diabetici? [Dillí 2009]
    Ans. (I) Inzulin byl dříve extrahován ze slinivky břišní poražených prasat a dobytka. Inzulin získaný z těchto zdrojů způsobil určitou alergii nebo jiné reakce na cizí protein.
    (II) Výroba lidského inzulínu společností Eli Lilly.
    Výroba inzulínu společností Eli Lilly
    (i) DNA sekvence odpovídající dvěma polypeptidovým, A a B-řetězcům inzulínu, jsou syntetizovány in vitro.
    (ii) Jsou zavedeny do plazmidové DNA E. coli.
    (iii) Tato bakterie je klonována za vhodných podmínek.
    (iv) Transgen je exprimován ve formě polypeptidů A a B sekretovaných do média.
    (v) Jsou extrahovány a kombinovány vytvořením disulfidického můstku za vzniku lidského inzulínu.
    Rozdíly mezi inzulínem produkovaným rDNA a inzulínem produkovaným slinivkou jsou:
    />Společnost k tomu použila technologii rDNA.
    (III) Výroba inzulínu společností Eli Lilly
    (i) DNA sekvence odpovídající dvěma polypeptidovým, A a B-řetězcům inzulínu, jsou syntetizovány in vitro.
    (ii) Jsou zavedeny do plazmidové DNA E. coli.
    (iii) Tato bakterie je klonována za vhodných podmínek.
    (iv) Transgen je exprimován ve formě polypeptidů A a B sekretovaných do média.
    (v) Jsou extrahovány a kombinovány vytvořením disulfidického můstku za vzniku lidského inzulínu.
    Rozdíly mezi inzulínem produkovaným rDNA a inzulínem produkovaným slinivkou jsou:
    />45. Vyjmenujte proces výroby tabákových rostlin odolných vůči háďátkům pomocí genetického inženýrství. Vysvětlete strategii přijatou pro vývoj takových rostlin. [Zahraniční 2011,2009 Celá Indie 2009,2008]
    Ans. Proces zapojený do produkce tabákových rostlin odolných vůči háďátkům se nazývá RNA interference (RNAi), která zahrnuje umlčení specifické mRNA.

    46. ​​Jedním z hlavních cílů biotechnologie je minimalizovat používání insekticidů na pěstované plodiny. Vysvětlete pomocí vhodného příkladu, jak byly pomocí biotechnologických technik vyvíjeny plodiny odolné proti hmyzu. [Dillí 2009 zahraniční 2008]
    Ans. Škůdci, kteří ničí vatové smotky, jsou červci bavlníkové a zavíječ bavlníkový. Bt bavlna se vyrábí pomocí některých kmenů bakterie Bacillus thuringiensis (krátká forma Btis).
    (i) Tato bakterie produkuje bílkoviny, které zabíjejí určitý hmyz, jako jsou Lepidopterani (háďátka tabáková a armádní červ), Coleopterani (brouci) a dvoukřídlí (mouchy a komáři).
    (ii) Bacillus thuringiensis tvoří proteinové krystaly během určité fáze svého růstu. Tyto krystaly obsahují toxický insekticidní protein.
    (iii) Protein toxinu Bt existuje jako neaktivní prototoxiny, ale jakmile hmyz pozře neaktivní toxin, přemění se na aktivní formu díky alkalickému pH střeva, které rozpouští krystaly.
    (iv) Aktivovaný toxin se váže na povrch epiteliálních buněk středního střeva a vytváří póry, které způsobují otok buněk a lýzu vedoucí ke smrti hmyzu.
    (v) Specifické geny Bttoxinu byly izolovány z Bacillus thuringiensis a začleněny do několika plodin.
    (vi) Většina Bttoxinů je specifická pro skupinu hmyzu. Proto je toxin kódován genem zvaným cry. Například proteiny kódované geny cry I Ac a cry lAb kontrolují bavlníkové tobolky a cry lAb kontrolují zavíječe kukuřičného.

    47. Rozbalte název enzymu ADA. Proč je enzym nezbytný v lidském těle? Na jeho nedostatek navrhněte genovou terapii. [Celá Indie 2009]
    Ans. ADA-adenosindeamináza. Je nezbytný pro správné fungování imunitního systému.
    Genová terapie pro nedostatek ADA je:
    Genová terapie je užitečná v případě nedostatku ADA.
    Dědičné onemocnění lze upravit genovou terapií. Jde o soubor metod, které umožňují korekci nebo náhradu defektního genu. První genová terapie byla podána v roce 1990 4leté dívce s deficitem adenosindeaminázy (ADA). Je způsobena delecí genu pro adenosindeaminázu.
    Léčba zahrnuje následující kroky:

    (i) Lymfocyty z krve pacienta jsou pěstovány na kultuře mimo tělo.
    (ii) Funkční ADA, cDNA (s použitím retrovirového vektoru) je pak zavedena do těchto lymfocytů.
    (iii) Takové geneticky upravené lymfocyty jsou vráceny do krve pacienta.
    (iv) Pacient vyžaduje pravidelnou infuzi takového geneticky upraveného lymfocytu.

    48. Co je nedostatek ADA? Popište tři způsoby, jak to vyléčit. [Celá Indie 2009]
    Ans. Deficit ADA je způsoben delecí genu pro adenosindeaminázu.
    Způsoby, jak vyléčit nedostatek ADA, jsou:
    (i) 1. způsob V některých případech může být vyléčena transplantací kostní dřeně a enzymatickou substituční terapií, ale není plně kurativní.
    (ii) 2. způsob Lymfocyty z krve pacienta byly pěstovány v kultuře a funkční ADA, cDNA byla do těchto lymfocytů zavedena pomocí retrovirového vektoru. Lymfocyty byly poté přeneseny do těla pacienta. Periodická infuze takto geneticky upravených lymfocytů se provádí, protože tyto buňky jsou smrtelné.
    (iii) 3. metoda Jedná se o trvalou metodu. Geny izolované z buněk kostní dřeně produkujících ADA jsou zavedeny do buněk v časném embryonálním stádiu.

    49. (i) Co je plazmid? (ii) Co znamená nedostatek ADA? Jak je genová terapie řešením tohoto problému? Proč to není trvalé vyléčení? [Dillí 2008 zahraniční 2008]
    Ans. (i) Plazmid je extra chromozomální, samoreplikující se kruhová dvouvláknová molekula DNA, která se přirozeně vyskytuje v bakteriích.
    (ii) Nedostatek ADA nastává v důsledku delece genu pro enzym adenosindeaminázu. Tento enzym je nezbytný pro fungování imunitního systému u lidí.
    V genové terapii se lymfocyty z krve pacientů pěstují v kultuře mimo tělo. Funkční ADA, cDNA je pak zavedena pomocí retrovirového vektoru do lymfocytů. Tyto lymfocyty jsou pak vráceny pacientovi.
    Protože tyto buňky nejsou nesmrtelné, pacient vyžaduje periodickou infuzi takto geneticky upravených lymfocytů

    50. (i) Proč je Bacillus thuringiensis považován za vhodný pro vývoj GM rostlin?
    (ii) Vysvětlete, jak byl použit k vývoji GM plodin. (Zahraničí 2008)
    Ans. (ii) Bacillus thuringiensis produkuje protein, který je toxický pro larvy hmyzu, jako je červec, pupenec, mouchy, brouk atd. Gen Bttoxin je klonován z bakterií a byl exprimován v rostlinách, aby zajistil odolnost proti hmyzu, aniž by bylo nutné chemické insekticidy.
    (ii) Metoda pro vývoj GM rostlin zahrnuje
    a) krygen kódující proteiny byl izolován pomocí restrikčních enzymů. Jsou klonovány ve vektorech a poté zavedeny do požadovaných plodin. Různé typy krygenů, které kódují kryproteiny specifické pro hmyz, jsou crylAc a cryllAb, které kontrolují můru bavlníkovou. crylAb ovládá zavíječ kukuřičný.
    (b) Transgenní rostliny, tj. Bt bavlník, Bt kukuřice, Bt rýže, produkují protein ve svých buňkách a vyjadřují odolnost proti hmyzím škůdcům.

    51. (i) Proč se některé rostliny bavlníku nazývají rostlinami Bt bavlny?
    (ii) Vysvětlete, jak je Bt bavlna odolná vůči škůdcům. [Dillí 2008C]
    Ans. i) Rostliny Btbavlníku jsou geneticky modifikované rostliny, které obsahují krygen získaný z Bacillus thuringiensis (Bt). Bttoxin je kódován crygenem a produkován bakterií Bacillus thuringiensis (Bt).
    (ii) Specifické geny Bt toxinu byly izolovány z této bakterie a začleněny do několika plodin, jako je bavlna, aby byla zajištěna odolnost proti hmyzu a škůdcům.
    Tyto rostliny bavlny obsahující geny Bt se proto nazývají rostliny bavlny Bt.
    Bt toxinové geny pláč IAc a pláč II Ab kontrolují vatové červy. Tyto geny jsou izolovány z bakterie a jsou začleněny do rostlin bavlníku.
    ‘cry geny’ v Bacillus thuringiensis kóduje toxické insekticidní proteiny, které existují jako neaktivní prototoxiny.
    Tyto proteiny, když jsou exprimovány v bavlníkových plodinách pomocí genetického inženýrství, propůjčují odolnost škůdcům proti bavlníkovi a brání poškození. Když se larvy tohoto hmyzu živí částmi rostlin bavlníku, toxin se aktivuje v jejich střevech, lyžuje jejich buňky a vede k smrti, čímž je činí odolnými vůči škůdcům.


    Poděkování

    Tato studie byla provedena těmito podporami: Granty-in-Aid pro kreativní vědecký výzkum (č. 18GS0313 pro HT), Vědecký výzkum v prioritních oblastech (č. 19060002 až HT č. 19060001 pro MS), Vědecký výzkum (A) (č. 17207005 pro HT a GH) Univerzita v Sydney (pro MEB) Deutsche Forschungsgemeinschaft (Le1412-3/1) a Institut pro podporu inovací prostřednictvím vědy a techniky ve Flandrech pro doktorandská a postdoktorandská stipendia a FP7-Marie Curie program pro stipendium IEF MC-273068 spolupracovníkům MVL Autoři děkují Organizačnímu výboru IBC 2011 za možnost uspořádat sympozium, jehož výsledkem je tento přehledový článek.


    IDENTIFIKACE BAKTERIÍ POMOCÍ 16S RRNA sekvenování

    Neidentifikované bakterie nebo izoláty s nejednoznačnými profily.

    Jedním z nejatraktivnějších potenciálních využití informatiky sekvencí genů 16S rRNA je poskytnout identifikaci rodů a druhů pro izoláty, které neodpovídají žádným uznávaným biochemickým profilům, pro kmeny, které generují pouze “low pravděpodobnost” nebo ȁpřijatelnou identifikaci” podle do komerčních systémů nebo pro taxony, které jsou zřídka spojovány s lidskými infekčními chorobami. Kumulativní výsledky z omezeného počtu dosavadních studií naznačují, že sekvenování genu 16S rRNA poskytuje identifikaci rodu ve většině případů (㺐%), ale méně s ohledem na druhy (65 až 83%), od 1 do 14& #x00025 z izolátů, které po testování zůstaly neidentifikovány (5, 11, 17). Potíže při získávání identifikace rodu a druhu zahrnují rozpoznání nových taxonů, příliš málo sekvencí uložených v nukleotidových databázích, druhy sdílející podobné a/nebo identické sekvence 16S rRNA nebo problémy s nomenklaturou vyplývající z více genomovarů přiřazených k jednomu druhu nebo komplexům.


    Podívejte se na video: Jay Leemo - Улетай Dj Geny Tur u0026 Techno Project remix (Prosinec 2022).