Informace

Jak mám poslat plazmidy?

Jak mám poslat plazmidy?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Odeslal jsem 10 µl svého vektorového miniprep spolupracovníkovi v 1,5 ml eppendorfově parafilmovaném uzávěru a nacpal jsem ho do 50 ml kónického obalu s vycpávkou z papírového ručníku. Cestou se však něco stalo a v tubě, když dorazila, nebylo nic (žádná kapalina). Nenapsali žádné komentáře k prasknutí mikrocentrifugační zkumavky nebo prasknutí parafilmu, takže se nic šíleného nestalo, ale něco ano.

Jaký je nejspolehlivější způsob přepravy plasmidů?


souhrn

  • 10 ul plasmidové minipreparace mohlo být nastříkáno do uzávěru zkumavky (AnnaF)
  • Eppendorfova zkumavka mohla být během přepravy vzduchu odtlakována a umožnila 10 ul uniknout a odpařit se
  • řešení: zkuste své minipřípravky před odesláním vzduchem vysušit nebo vysát (Jonas).

Podrobnosti

Jak napsala AnnaF, 10 ul vašeho plazmidu mohlo být skryto v uzávěru nebo rozptýleno kolem zkumavky, takže by se mohlo zdát prázdné. Měli byste se u svých spolupracovníků ujistit, že to odstředili.

Podle dokumentu fedex o přepravě zboží podléhajícího zkáze (pdf) a dokumentu měřícího teplotu a tlak leteckých zásilek (pdf) mohou zásilky fedex a ups air zažít prostředí s nízkým tlakem kolem 0,56 – 0,74 atmosféry (atm). Při těchto relativně nízkých tlacích by možná mohla prasknout Eppendorfova trubice utěsněná na 1 atm. Noviny také poznamenávají, že pozemní zásilky, které projíždějí přes skalnaté útesy (tj. v Coloradu), mohou utrpět ~ 0,64 atm.

Takže možná byla vaše 1,5ml zkumavka Eppendorf během přepravy odtlakovaná?

Bylo by zajímavé provést nějaké testy tlakové odolnosti eppendorfových trubic.

Pokud jde o původní otázku, v roce 2007 jsem připravil a odeslal (fedex) knihovnu tisíců miniprep stovkám uživatelů. 1 ul miniprep byl rozdělen do jamek 384jamkových destiček a sušen na vzduchu, poté utěsněn hliníkem a poté odeslán poštou. Uživatelé rehydratují studnu 10 ul vody. Obecně to funguje.


Docela bezpečným způsobem přepravy plazmidů je umístit je na filtrační papír (viz protokol a poslat dopis. Mnohem levnější.


Zkoušeli zkumavku odstředit, když se tam dostala, aby vytlačila všechnu kapalinu na dno? Vím, že zvláště při práci s tak malým množstvím, že i malé zatřepání může rozptýlit obsah po celé tubě. Již dříve jsme obdrželi plazmidy z jiných laboratoří. Obecně řečeno, plazmidy se zasílají v mikrocentrifugačních zkumavkách se šroubovacím uzávěrem uvnitř nějakého druhu kanystru. To se pak zabalí do malého pěnového chladiče se suchým ledem, aby vše zůstalo chladné.


Protože zkumavky lze rozdrtit poštou, nejbezpečnějším způsobem přepravy plazmidů je nakapat několik ul do filtračního papíru a poté jej zabalit, aby se utěsnil parafilmem, a vyplnit podrobný formulář o jeho obsahu.

Hodně štěstí.


Dostali jsme se do podobných situací, když nám jiné laboratoře poslaly plazmidy (nebo když jsme vyndali staré zkumavky ze skladovacích boxů při -20), a od té doby jsme přijali metodu filtračního papíru. Dalším bodem, který je třeba poznamenat, je, že do „prázdné“ zkumavky (Mac) můžete přidat řekněme 10 μl vody a použít 1 μl pro transformaci. U nás to vždy fungovalo. DNA je zdánlivě neviditelná!


Důrazně také doporučuji nasát mikrogram vaší plazmidové DNA na kousek filtračního papíru (filtrační papír je důležitý pro extrakci na přijímací straně). Také je velmi užitečné, když jasně označíte množství DNA (přibližně) a zakroužkujete blotovanou DNA v peru, takže nevznikají žádné nejasnosti ohledně vyříznutí kruhu z filtračního papíru obsahujícího DNA.

Na přijímací straně byste měli vždy papír okamžitě zmrazit nebo eluovat DNA z papíru v TE pufru nebo vodě a poté zmrazit. Pokud tak neučiníte, povede to nakonec k degradaci DNA plazmidu DNAázou a pak budete muset čekat na další zásilku.


Plazmidy

David P. Clark, . Michelle R. McGehee , v Molekulární biologii (třetí vydání), 2019

2 Obecné vlastnosti plazmidů

Plazmidy jsou obvykle kruhové molekuly DNA, i když příležitostně existují plazmidy, které jsou lineární nebo vyrobené z RNA. Mohou být nalezeny jako jednotlivé nebo vícenásobné kopie a mohou nést půl tuctu až několik stovek genů. Plazmidy se mohou množit pouze uvnitř hostitelské buňky. Většina plazmidů obývá bakterie a skutečně asi 50 % bakterií nalezených ve volné přírodě obsahuje jeden nebo více plazmidů. Plazmidy se také nacházejí ve vyšších organismech, jako jsou kvasinky a houby. 2mikronový kruh kvasinek (diskutovaný později) je dobře známým příkladem, který byl upraven pro použití jako klonovací vektor.

Většina plazmidů je kruhová, tvořená DNA a mnohem menší než chromozomy.

The číslo kopie je počet kopií plazmidu v každé bakteriální buňce. Pro většinu plazmidů je to 1 nebo 2 kopie na chromozom, ale může to být až 50 nebo více pro určité malé plazmidy, jako jsou plazmidy ColE. Počet kopií ovlivňuje sílu charakteristik přenášených plasmidem, zejména antibiotickou rezistenci. Čím více kopií plazmidu na buňku, tím více kopií bude existovat genů rezistence na antibiotika, a tím vyšší je výsledná úroveň rezistence na antibiotika.

Velikost plazmidů se velmi liší. F-plasmid z Escherichia coli je v tomto ohledu poměrně průměrný a je asi 1 % velikosti E-coli chromozóm. Většina vícekopiových plazmidů je mnohem menší (plazmidy ColE jsou asi 10 % velikosti F-plazmidu). Někdy jsou nalezeny velmi velké plazmidy, až 10 % velikosti chromozomu, ale je obtížné s nimi pracovat a jen málo z nich bylo řádně charakterizováno (viz rámeček 23.02).

Když genom gramnegativní bakterie Vibrio cholerae, původce cholery, byl sekvenován, bylo zjištěno, že sestává ze dvou kruhových chromozomů o 2 961 146 a 1 072 314 bp. Dohromady to tvoří přibližně 4 miliony párů bází a kóduje asi 3900 proteinů – přibližně stejné množství genetické informace jako E-coli. Na menším chromozomu bylo nalezeno mnoho genů, které zřejmě mají původ mimo střevní bakterie, jak vyplývá z jejich odlišného základního složení. Mnohé z těchto genů postrádají homologii s charakterizovanými geny a mají neznámou funkci. Menší chromozom také nese systém pro zachycení integronového genu (viz kapitola 25: Mobilní DNA) a hostí geny „závislosti“, které se typicky nacházejí na plazmidech (probráno později). Kromě toho se menší chromozom replikuje jiným mechanismem než velký chromozom. Ve skutečnosti menší chromozom sdílí replikační systém s rodinou široce distribuovaných plazmidů. Zdá se pravděpodobné, že menší chromozom vznikl jako plazmid, který narostl do své současné velikosti akumulací genů z nejrůznějších vnějších zdrojů. Možná je lepší považovat menší chromozom za „megaplazmid.Údaje o sekvenci genomu naznačují, že asi 10 % bakterií nese takové megaplazmidy, i když velikost se značně liší. Ve většině těchto případů nese větší chromozom téměř všechny geny potřebné pro životně důležité buněčné funkce, jako je syntéza proteinů, RNA a DNA. V několika případech se takové megaplazmidy mohou přenést na příbuzné bakterie konjugací.

Některé plazmidy jsou přítomny v jedné nebo dvou kopiích na buňku, zatímco jiné se vyskytují ve více kopiích.

Plazmidy nesou geny pro řízení svých vlastních životních cyklů a některé plazmidy nesou geny, které ovlivňují vlastnosti hostitelské buňky. Tyto vlastnosti se velmi liší plazmid od plazmidu, nejznámější je rezistence na různá antibiotika. Kryptické plazmidy jsou ty, které hostitelské buňce neudělují žádný identifikovatelný fenotyp. Kryptické plazmidy pravděpodobně nesou geny, jejichž charakteristiky jsou stále neznámé. Plazmidy, které jsou modifikovány pro různé účely, se používají ve výzkumu molekulární biologie a často se používají k přenášení genů během genetického inženýrství.

Rozsah hostitelů plazmidů se široce liší. Některé plazmidy jsou omezeny na několik blízce příbuzných bakterií, například F-plazmid obývá pouze E-coli a podobné střevní bakterie Shigella a Salmonella. Jiní mají široký rozsah hostitelů, například plazmidy P-rodiny mohou žít ve stovkách různých druhů bakterií. Ačkoli „P“ je nyní obvykle považováno za označení „promiskuitní“, kvůli jejich neobvykle široké škále hostitelů, byly tyto plazmidy původně pojmenovány po Pseudomonas, bakterie, ve které byly objeveny. Často jsou zodpovědné za rezistenci vůči více antibiotikům, včetně penicilinů.

Některé plazmidy se mohou samy pohybovat z jedné bakteriální buňky do druhé, což je vlastnost známá jako přenositelnost . Mnoho středně velkých plasmidů, jako jsou plasmidy F-typu a P-typu, to dokáže a jsou označovány jako Tra+ (transfer-pozitivní). Protože přenos plazmidu vyžaduje více než 30 genů, tuto schopnost mají pouze střední nebo velké plazmidy. Velmi malé plazmidy, jako jsou plazmidy ColE, jednoduše nemají dostatek DNA pro umístění potřebných genů. Nicméně mnoho malých plazmidů, včetně ColE plazmidů, má mobilizovatelnosti což znamená, že mohou být mobilizovány samopřenosnými plazmidy [tj. jsou Mob + (mobilizační pozitivní)]. Ne všechny přenosově negativní plazmidy však mohou být mobilizovány. Některé přenositelné plazmidy (např. F-plazmid) mohou také mobilizovat chromozomální geny. Právě toto pozorování umožnilo původní vývoj bakteriální genetiky pomocí E-coli. Mechanismus přenosu plazmidu a podmínky nezbytné pro přenos chromozomálních genů jsou proto diskutovány v kapitole 28, Bakteriální genetika.

Některé plazmidy se mohou přenášet mezi bakteriálními buňkami a několik může také přenášet chromozomální geny.

2.1 Rodiny a nekompatibilita plazmidů

Dva různé plazmidy, které patří do stejné rodiny, nemohou koexistovat ve stejné buňce. Toto je známé jako nekompatibilita . Plazmidy byly původně klasifikovány podle inkompatibility, a tak plazmidové rodiny jsou často známé jako skupiny nekompatibility a jsou označeny písmeny abecedy (F, P, I, X atd.). Plazmidy stejné skupiny nekompatibility mají velmi podobné sekvence DNA ve svých replikačních a rozdělovacích genech, i když ostatní geny, které nesou, mohou být velmi odlišné. Je docela možné mít dva nebo více plazmidů ve stejné buňce, pokud patří do různých rodin. Plazmid typu P bude tedy šťastně sdílet stejnou buňku s plazmidem z rodiny F (obr. 23.03).

Obrázek 23.03. Plazmidová nekompatibilita

Plazmidy s různými počátky replikace a různými replikačními geny jsou schopny obývat stejnou bakteriální buňku a jsou považovány za kompatibilní (vlevo). Během buněčného dělení se oba typy plazmidu replikují, takže každá dceřiná buňka zdědí oba plazmidy, stejně jako mateřská buňka. Na druhou stranu, pokud dva plazmidy mají identické počátky a replikační geny, jsou nekompatibilní a nebudou se replikovat během buněčného dělení (vpravo). Místo toho jsou dva plazmidy rozděleny do různých dceřiných buněk.

Plazmidy jsou klasifikovány do rodin, jejichž členové sdílejí velmi podobné replikační geny.

2.2 Občasné plazmidy jsou lineární nebo vyrobené z RNA

Ačkoli většina plazmidů jsou kruhové molekuly DNA, existují občasné výjimky. Lineární plazmidy dvouvláknové DNA byly nalezeny v různých bakteriích a v houbách a vyšších rostlinách. Nejlépe charakterizované lineární plazmidy se nacházejí v těch několika bakteriích, jako je např Borrelie a Streptomyces které také obsahují lineární chromozomy. Lineární replikony DNA v bakteriích nejsou chráněny telomerami jako lineární chromozomy eukaryot. Místo toho různé individuální úpravy chrání konce před endonukleázami.

Lineární plazmidy mají speciální struktury k ochraně konců DNA.

v Borrelie, ve skutečnosti neexistují žádné volné konce DNA. Místo toho vlásenkové sekvence jednovláknové DNA tvoří smyčky na koncích lineárních plazmidů i chromozomů (obr. 23.04A). Některé zvířecí viry, jako je iridovirus, který způsobuje africký mor prasat, mají podobnou strukturu. Různé druhy Borrelie způsobit Lymeovu chorobu a recidivující horečku. Zdá se, že jejich lineární plazmidy kódují jak hemolyziny, které poškozují krevní buňky, tak povrchové proteiny, které chrání bakterie před imunitním systémem hostitele. Tak, jak je tomu u mnoha jiných infekčních bakterií, faktory virulence Borrelie jsou také z velké části přenášeny plasmidem.

Obrázek 23.04. Koncové struktury lineárních plazmidů

(A) Lineární plazmidy Borrelie na koncích vytvořte smyčky vlásenky. (B) Lineární plazmidy Streptomyces jsou potaženy proteiny, které chrání konce DNA. Pokud by lineární plazmidy exponovaly dvouvláknové konce, spustilo by to rekombinační, opravné nebo degradační systémy.

Lineární plazmidy Streptomyces jsou skutečně skutečné lineární molekuly DNA s volnými konci. Mají obrácené repetice na koncích DNA, které drží pohromadě proteiny. Kromě toho jsou na 5′ koncích DNA kovalentně připojeny speciální ochranné proteiny. Čistým výsledkem je struktura tenisové rakety (obr. 23.04B). DNA adenoviru, většiny lineárních eukaryotických plazmidů a některých bakteriálních virů vykazují podobné struktury.

Lineární plazmidy se také nacházejí mezi eukaryoty. Houba Flammulina velutipes, běžně známá jako houba enoki, má ve svých mitochondriích dva velmi malé lineární plazmidy. Je také známo několik vyšších rostlin, které mají ve svých mitochondriích lineární plazmidy. Mléčné droždí, Kluyveromyces lactis, má lineární plazmid, který se normálně replikuje v cytoplazmě. Někdy se však plazmid přemístí do jádra, kde se replikuje jako kruh. Cirkularizace je způsobena místně specifickou rekombinací zahrnující invertované repetice na koncích lineární formy plazmidu. Fyziologická role těchto plazmidů je nejasná.

RNA plazmidy jsou vzácné a většina z nich je špatně charakterizována. Příklady jsou známy z rostlin, hub a dokonce i zvířat. Některé kmeny kvasinek Saccharomyces cerevisiae obsahují lineární RNA plazmidy. Podobné RNA plazmidy se nacházejí v mitochondriích některých odrůd kukuřičných rostlin. Plazmidy RNA se nalézají jako jednovláknové i dvouvláknové formy a replikují se podobným způsobem jako některé RNA viry. RNA plazmid kóduje RNA-dependentní RNA polymerázu, která řídí jeho vlastní syntézu. Na rozdíl od RNA virů neobsahují RNA plazmidy geny pro obalové proteiny. Srovnání sekvencí naznačuje, že většina RNA plazmidů jsou pouze defektní verze RNA virů, které se trvale usadily poté, co ztratily schopnost pohybovat se z buňky do buňky jako virové částice.


Jak rozpoznat plazmid na papíře pro přepravu? - (9. února 2006)

Potřebuji poslat plazmid (jednomu z našich spolupracovníků v laboratoři) blotováním na filtrační papír. Může mi někdo říct přesný postup, jak to udělat: jaké je množství DNA, které má být zpozorováno, jaký papír použít, jak dlouho ho nechat sedět atd. Díky.

Svůj plazmid můžete najít na kusu filtračního papíru. Před špiněním můžete na papír nakreslit kruh pomocí tužky, aby příjemce věděl, kde se nachází. Neexistuje žádný skutečný limit na množství plazmidu, které můžete zaznamenat, vše závisí na koncentraci vaší DNA.

Takže namočíš ten kousek filtračního papíru do kompu a transformuješ nebo co?

Už jsem o této technice slyšel, ale nezkoušel jsem ji.

Takže namočíš ten kousek filtračního papíru do kompu a transformuješ nebo co?

Už jsem o této technice slyšel, ale nezkoušel jsem ji.

namočíte kus filtračního papíru do TE (vezmu sterilní špičku a trochu ji rozdrtím), pak vezměte řekněme 5-10 ul a transformujte.

Ahoj, Matte, pokud hledáte nějaké technické reference, je to komerčně dostupné jako produkt s názvem Clonesaver


Experimentální procedura

Digest a purifikovat vektor:

Během čekání na příchod vašich oligo proveďte restrikční štěpení 1 μg vektoru pomocí EcoRI a SalI

Spusťte agarózový gel a vyřízněte proužek obsahující vaši vektorovou DNA

Gel purifikujte svou DNA mimo agarózu pomocí komerčně dostupné soupravy nebo standardního protokolu.

Anneal oligos:

Oliga by měla být resuspendována v nasedacím pufru (10 mM Tris, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCL, 1 mM EDTA) a smíchána v ekvimolárních koncentracích. Doporučujeme smíchat po 2 μg v celkovém objemu 50 μL – v případě potřeby přidejte další žíhací pufr, abyste dosáhli objemu 50 μL. Účinného žíhání lze dosáhnout jedním ze dvou způsobů:

Umístěte smíchané oligo do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky.

Umístěte zkumavku do horkého bloku 90-95°C a nechte 3-5 minut.

Odstraňte horký blok ze zdroje tepla (vypněte nebo přesuňte blok na pracovní desku), aby bylo možné pomalu ochlazovat na pokojovou teplotu (

Umístěte smíšené oligo do zkumavky PCR.

Umístěte zkumavku na 2 minuty do termocykleru naprogramovaného pro začátek při 95 °C.

Poté postupně ochlaďte na 25 °C během 45 minut.

Ligace:

Zřeďte 5 μl žíhaných oligo s 45 μl vody bez nukleázy a kvantifikujte koncentraci (měla by být asi 8 ng/μl).

Smíchejte hybridizovaná oligo s štěpeným vektorem v molárních poměrech (vektor:insert) mezi 4:3 a 1:6 ve standardní ligační reakci (např. pro ligaci anelovaného oligo insertu o délce 50 bp do 5kb vektoru smíchejte 100 ng vektor s 0,75-6 ng nasednutých oligo).

Transformujte 2-3 μl na své oblíbené kompetentní bakterie a misku.

Ujistěte se, že jste vybrali více kolonií pro minipreparaci a ověřte insert sekvenováním.


Typy kontrolních plazmidů

Součástí plánování vašeho experimentu je stanovení faktorů, které je třeba kontrolovat, aby se eliminovala jakákoli alternativní interpretace výsledků. Experimenty založené na plazmidu typicky využívají transfekci, negativní, pozitivní a replikační kontroly.

Kontroly transfekce: prázdný vektor a vnitřní kontrola

Kontrola transfekce měří účinnost transfekce a umožňuje pozorování jakýchkoli účinků, které samotná transfekce (tj. vektor použitý při transfekci, transfekční činidlo nebo proces transfekce) může mít na cílové buňky. Jedna kontrola transfekce je specificky prázdná vektorová kontrola, plazmid bez nezávislé proměnné. S odkazem zpět na experiment spojený s obrázkem 1, nezávislou proměnnou je shRNA. Prázdným kontrolním vektorem by tedy byl plazmid A sans shRNA nebo samotný hlavní řetězec Y. Kontrola prázdného vektoru vám umožňuje zkoumat, zda transfekční činidla nebo samotný proces transfekce mají nějaké cytotoxické účinky na cílové buňky.

Dalším typem kontroly transfekce je vektor vnitřní kontroly, který měří účinnost transfekce. Vnitřní kontrolou může být plazmid, který konstitutivně exprimuje reportérový protein (např. GFP nebo luciferázu), který je buď kotransfekován s testovaným plazmidem, nebo transfekován do samostatné jamky vašich buněk. Bez ohledu na to, množství aktivity reportérového proteinu koreluje jak s množstvím DNA transfekované do buněk, tak se schopností buněk exprimovat protein.

Při analýze výsledku na obrázku 1 mohla vnitřní kontrola, jako je plazmid B exprimující GFP, prokázat, zda byly buňky úspěšně transfekovány a exprimují protein. Například snímky fluorescenční mikroskopie pocházející z našeho experimentu, který zahrnuje výše uvedenou vnitřní kontrolu a jsou konzistentní s výsledkem na obrázku 1, by mohly vypadat takto:

Obrázek 2: Exprese plazmidu B (jako vnitřní kontrola)

Tento výsledek ukazuje, že transfekce nebyla úspěšná kvůli absenci fluorescence GFP z živých, životaschopných buněk. Tento výsledek představuje příležitost pro odstraňování problémů a optimalizaci transfekčních činidel a procesu. Je důležité poznamenat, že optimální experimentální podmínky, včetně toho, kolik plazmidové DNA použít pro jednotlivce nebo kotransfekci, by měly být stanoveny empiricky.

Negativní kontroly: neošetřené buňky, kontrola s prázdným vektorem a kontrola bez cílení

Negativní kontrolní podmínky a plazmidy by měly vyvolat nulový efekt (tj. nebyl pozorován žádný jev). V každém experimentu založeném na plazmidu by měly být zahrnuty neošetřené buňky, protože poskytují základní linii/standard, se kterými lze porovnávat jiné vzorky.

Empty Vector Control (zmíněný výše) může také sloužit jako důležitá negativní kontrola. V tomto kontextu prázdný vektorový ovládací prvek ukazuje jakýkoli účinek samotného vektoru/páteře na genovou expresi ve vašich cílových buňkách.

V experimentech využívajících technologie genového cílení nebo úpravy genomu, jako je RNAi nebo CRISPR, mohou být vhodné necílené kontroly, protože vám umožňují posoudit specifičnost vašeho pozorovaného výsledku. Necílové kontroly jsou negativní kontroly, které produkují podobný produkt, ale nezaměřují se na endogenní gen ve vašich experimentálních buňkách. Například ve výše uvedeném experimentu plazmid A obsahuje shRNA, která cílí na lidský gen X a lidské buňky jsou transfekovány. Správnou necílenou kontrolou v tomto experimentu by mohla být shRNA – ve stejné páteři jako plazmid A – která necílí na žádný savčí gen. Tato necílená kontrola je kritická pro správnou interpretaci výsledků, protože poskytuje důležitý referenční bod při analýze specificity shRNA zacílené na lidský gen X. Necílená kontrola také posuzuje jakékoli účinky obecného zavedení shRNA do vašeho cílové buňky.

Pozitivní kontroly

Pozitivní kontrolní plazmidy by měly vyvolat očekávaný jev. Jeden příklad pozitivní kontroly, vektor vnitřní kontroly, byl popsán dříve. Jakmile jste si jisti, že vaše podmínky vedou k úspěšnému dodání plazmidové DNA do buněk, vnitřní kontrolní vektor pak slouží jako pozitivní kontrola pro transfekci, protože vytváří očekávaný efekt, kterým jsou zeleně fluoreskující buňky (obrázek 3).

Obrázek 3: Exprese plazmidu B (jako pozitivní kontrola)

Ostatní pozitivní kontroly jsou specifické pro experiment a měly by být podle toho navrženy. Pokud se pokoušíte aktivovat gen, měli byste navrhnout kontrolu, která vykazuje maximální aktivaci. Podobně, pokud se snažíte potlačit gen, vaší kontrolou může být systém, kde je exprese tohoto genu zcela vyřazena. Tyto kontroly mohou nebo nemusí být založeny na plasmidu v závislosti na experimentálních potřebách. Použijeme-li náš experiment jako příklad, očekávaným výsledkem shRNA cílené na lidský gen X v plazmidu A je snížená exprese genu X. Pozitivní kontrola by tedy měla snížit expresi genu X.

Protože klíčovým rysem kontrolního plazmidu je minimalizovat účinky nesamostatných proměnných v rámci experimentu, jak design, tak výběr pozitivních kontrolních plazmidů by měl být vysoce specifický pro experiment a dotazování nezávislé proměnné.


Jak se replikace spouští a zastavuje?

Kromě genů plazmidy často zahrnují transkripční promotory a terminátory odvozené od E-coli fágy. Často se používají promotory z fágů SP6 a T7 in vitro Amplifikace RNA. Vyžadují fágové polymerázy, a proto jsou neaktivní in vivo.

Níže je a mapa pTLNX, expresního vektoru pro oocyty Xenopus (obrázek 2). Kromě známých genů původu pBR322 a rezistence na antibiotika AmpR a CmR (rezistence na chloramfenikol), jsou přítomny také promotory SP6 a lacUV. Po směru od promotoru SP6 umožňuje terminátor rrnBT2 účinnou terminaci genů klonovaných do vícenásobného klonovacího místa 2 (obrázek 2).

Vektor pTLNX má také gen pro selekci plazmidu (ccdB), spolu s jaderným lokalizačním signálem viru SV40 a 3' UTR Xenopus globine, který umožňuje vysoké úrovně exprese klonovaných genů.


Mnoho bakterií obsahuje extrachromozomální prvky DNA tzv plazmidy. Jsou to obvykle malé (několik 1000 bp), kruhové dvouvláknové molekuly, které se replikují nezávisle na chromozomu a mohou být přítomny ve vysokém počtu kopií v buňce. Ve volné přírodě mohou být plazmidy přenášeny mezi jedinci během bakteriálního páření a někdy jsou dokonce přenášeny mezi různými druhy. Plazmidy jsou zvláště důležité v medicíně, protože často nesou geny pro patogenitu a rezistenci vůči lékům. V laboratoři mohou být plazmidy vloženy do bakterií v procesu zvaném transformace.

Pro vložení fragmentu DNA do plazmidu se fragment i kruhový plazmid štěpí pomocí restrikčního enzymu, který vytváří kompatibilní konce (obrázek (PageIndex<1>)). Vzhledem k velkému počtu restrikčních enzymů, které jsou v současné době k dispozici, není obvykle příliš obtížné najít enzym, pro který jsou přítomny odpovídající rozpoznávací sekvence jak v plazmidu, tak ve fragmentu DNA, zejména proto, že většina plazmidových vektorů používaných v molekulární biologii byla zkonstruována. obsahovat rozpoznávací místa pro velký počet restrikčních endonukleáz.

Obrázek (PageIndex<1>): Klonování fragmentu DNA (červeně) do plazmidového vektoru. Vektor již obsahuje selektovatelný markerový gen (modrý), jako je gen rezistence na antibiotika. (Originál-Deyholos-CC:AN)

Po restrikčním štěpení mohou být požadované fragmenty dále purifikovány nebo selektovány předtím, než jsou smíchány dohromady s ligázou, aby se spojily. Po krátké inkubaci jsou nově ligované plazmidy obsahující požadovaný gen přeměněna do E-coli. Transformace se provádí smícháním ligované DNA s E-coli buňky, které byly speciálně připraveny (tj kompetentní) k vychytávání DNA. Kompetentní buňky lze vytvořit expozicí sloučeninám, jako je CaCl2 nebo do elektrických polí (elektroporace). Protože pouze malá část buněk, které jsou smíchány s DNA, bude skutečně transformována, a volitelný markerNa plazmidu je obvykle také přítomen gen pro rezistenci na antibiotika. Po transformaci (zkombinování DNA s kompetentními buňkami) se bakterie nanesou na bakteriální agarovou plotnu obsahující vhodné antibiotikum, takže pouze ty buňky, které skutečně inkorporovaly plazmid, budou schopny růst a tvořit kolonie. To pak lze vybrat a použít pro další studium.

Molekulární biologové používají plazmidy jako vektory obsahovat, amplifikovat, přenášet a někdy exprimovat geny zájmu, které jsou přítomny v klonované DNA. Prvním krokem v molekulárně biologickém experimentu je často klon (tj. zkopírujte) gen do plazmidu, poté transformujte tento rekombinantní plazmid zpět na bakterii, aby bylo možné vytvořit v podstatě neomezené kopie genu (a plazmidu, který jej nese), jak se bakterie množí. To je praktickou nutností pro další manipulace s DNA, protože většina technik molekulární biologie není dostatečně citlivá, aby mohla pracovat pouze s jednou molekulou najednou. Mnoho experimentů molekulárního klonování a rekombinace je proto iterativními procesy, ve kterých:

  1. fragment DNA (obvykle izolovaný pomocí PCR a/nebo restrikčním štěpením) je klonován do plazmidu štěpeného kompatibilním restrikčním enzymem
  2. rekombinantní plazmid je transformován do bakterií
  3. bakterie se nechají množit, obvykle v tekuté kultuře
  4. z bakteriální kultury je izolováno velké množství rekombinantní plazmidové DNA
  5. další manipulace (jako je místně cílená mutageneze nebo vložení dalšího kusu DNA) se provádějí na rekombinantním plazmidu
  6. modifikovaný plazmid je znovu transformován do bakterií před dalšími manipulacemi nebo pro expresi

Aplikace molekulárního klonování: produkce rekombinantního inzulínu

Purifikovaný inzulinový protein je rozhodující pro léčbu diabetu. Před

V roce 1980 byl inzulín pro klinické použití izolován z lidských mrtvol nebo z poražených zvířat, jako jsou prasata. Lidský inzulín měl obecně lepší farmakologické vlastnosti, ale byl v omezeném množství a nesl riziko přenosu onemocnění. Klonováním genu pro lidský inzulín a jeho expresí E-coliVe fermentorech by mohla být bezpečně a efektivně produkována velká množství inzulínu identického s lidským hormonem. Produkce rekombinantního inzulínu také umožňuje produkci specializovaných variant proteinu: například změnou několika aminokyselin lze vytvořit déle působící formy hormonu. Aktivní inzulínový hormon obsahuje dva peptidové fragmenty o 21 a 30 aminokyselinách. Dnes se v podstatě veškerý inzulín vyrábí z rekombinantních zdrojů (obrázek (PageIndex<2>)), tj. lidských genů a jejich derivátů exprimovaných v bakteriích nebo kvasinkách.

Obrázek (PageIndex<2>): Lahvička inzulínu. Všimněte si, že štítek uvádí původ jako &ldquorDNA&rdquo, což znamená rekombinantní DNA. (Flickr-DeathByBokeh-CC:AN)


Plazmid je kruhová dvouvláknová molekula DNA, která se obvykle nachází v bakteriích a je schopna replikace nezávisle na chromozomální DNA buňky. Plazmidy obvykle umožňují bakteriím vyvinout nějakou výhodu, jako je odolnost vůči antibiotikům. Bakteriální buňka může mít více než jeden plazmid, bude exprimovat geny na těchto plazmidech a bude replikovat každý plazmid, když se dělí. Tímto způsobem každá dceřiná buňka získá kopii plazmidu. Plazmidy se často používají pro účely klonování, protože požadované geny (fragmenty DNA) mohou být vloženy do plazmidů a zavedeny do bakterií pomocí bakterií. proměna. Při bakteriální transformaci mohou kompetentní bakterie, jejichž buněčná stěna je propustná pro genetický materiál, přijímat cizí plazmid. Bakterie, které přijaly plazmid, mohou být vybrány obvykle pěstováním bakterií v určitém antibiotiku, na které plazmidová DNA umožňuje rezistenci. Tímto způsobem, jak bakterie rozdělují plazmid, a tím se geny na nich amplifikují.

Jsou to enzymy, které štěpí DNA na specifických rozpoznávacích místech, která jsou obvykle dlouhá 4 až 8 párů bází. Místa jsou obvykle také palindromická, což znamená, že čtou stejně dopředu i dozadu. Restrikční enzymy také vytvoří „lepivé“ nebo „tupé“ konce. Tyto konce mohou být použity k vložení požadovaného genu do plazmidu ligací.

Př. Lepivý konec, kde základny zůstanou po řezu nespárované

Př. Tupý konec, kde jsou všechny základny po řezu spárovány


NOVÉ VELIKOSTI

The Databáze CGSC z E-coli genetická informace zahrnuje genotypy a referenční informace pro kmeny v kolekci CGSC názvy, synonyma, vlastnosti a pozice na mapě geny, genový produkt informace a informace o konkrétních mutace a odkazy na primární literaturu. Veřejná verze databáze obsahuje tyto informace a lze se na ni dotazovat přímo přes tento CGSC DB WebServer. Pro pomoc použijte odkazy na nápovědu umístěné výše a na každém dotazovacím formuláři nebo nás kontaktujte přímo.


Nejčastější dotazy – Expresní doprava (eShipGlobal)

Ne. Když používáte eShipGlobal, nebudete zadávat číslo účtu. Číslo účtu je již naprogramováno v eShipGlobal pro Yale a není přístupné koncovým uživatelům.

  • zlepšuje přesnost fakturace prostřednictvím ověřování účtování
  • šetří váš čas a peníze
  • vám poskytuje zvýhodněné ceny Yale
  • dává možnost sledovat vaše objednávky
  • zvyšuje efektivitu díky rychlému přístupu k informacím o odesílateli/příjemci
  • e-maily sledující informace ostatním v případě potřeby

Použití eShipGlobal je doporučený přístup pro objednávání expresních přepravních služeb na Yale.

Ano. Yale dostává konkurenční mezinárodní sazby od FedEx, UPS, DHL a USPS, takže používání eShipGlobal pro mezinárodní zásilky FedEx, UPS, DHL a USPS je vhodné z tohoto důvodu, stejně jako pro další výhody uvedené výše.

Ne. V současné době je eShipGlobal nastaven pouze pro použití s ​​pokyny pro platby z univerzity, nikoli s osobními kreditními kartami, které by byly vyžadovány pro zpracování osobní transakce.

Pokud uděláte chybu nebo potřebujete aktualizovat štítek, musíte zásilku zrušit a vytvořit nový štítek. Vezměte prosím na vědomí, že štítek nemůžete upravit ani znovu použít. Podle návrhu musí mít každý balík jedinečný přepravní štítek, protože každý čárový kód je pro dopravce kontrolním bodem.

Dobrou zprávou je, že eShipGlobal vám také dává možnost zrušit zásilku sami a vytvořit nový štítek, nikoli volat přepravci, aby zásilku zrušil, což obvykle vede k poplatku za opravu ve výši 10 USD.

Zrušit doručení balíku po jeho vložení do schránky nebo vyzvednutí přepravcem je pozdě.

Přestože vám nebudou fakturovány zásilky, které přepravce nepřevzal, doporučuje se zrušit nepoužité štítky. Pro zrušení ve stejný den klikněte na Moje zásilky z hlavního navigačního okna eShipGlobal, poté zvolte Historie zásilek, zadejte sledovací číslo nebo číslo objednávky do zobrazeného pole a klikněte generovat, vyberte balíček, který chcete zrušit, a poté klikněte zrušení.

Pokud jste dříve vytvořili přepravní štítek, který je z jiného data (ne dnes), pošlete e-mail na support@eship&# 103lobal.com. E-mail by měl obsahovat sledovací číslo zásilky, kterou chcete zrušit, a eShipGlobal zruší zásilku vaším jménem.

Ano, pokud nepoužíváte schránku, která patří dopravci, nebo máte s dopravcem stanovený plán vyzvednutí, budete i tak muset upozornit doručovací službu, aby si balíček vyzvedla k doručení.

eShipGlobal má praktickou funkci zvanou Drop Locator. Stačí si vybrat přepravce a poté zadat svou adresu a bude hledat schránku, která je vám nejblíže.

Po vstupu do eShipGlobal klikněte na „Supplies“ v horní části stránky pro pokyny k objednání spotřebního materiálu od FedEx, UPS, DHL a USPS.

Výzkumné materiály jsou obecně definovány jako materiály, které se používají v laboratorních podmínkách, jako jsou zvířata, biologické (kultury nebo zásoby lidských nebo zvířecích patogenů, vybraná činidla nebo toxiny, lidské nebo zvířecí materiály, geneticky modifikované mikroorganismy, vektory, plazmidy atd.) chemické nebo radioaktivní a suchý led.

Některé výzkumné materiály nemusí být nutně nebezpečné, ale po přepravě se stanou regulovanými materiály.

Ano. Pro zlepšení souladu je eShipGlobal integrován se systémem TMS společnosti Yale. Když se přihlásíte pomocí svého Yale NetId a hesla, systém zajistí automatické ověření školení.

Školicí kurzy pro biologické látky a balíčky suchého ledu jsou k dispozici online. Ve většině případů, pokud požadujete školení, budete schopni splnit požadavek školení a odeslat svůj balíček ve stejný den.

Přestože společnost a kontaktní údaje nelze upravit, protože jsou propojeny se systémem TMS pro ověření školení, můžete změnit svou dodací adresu. V rámci přepravního formuláře Research Materials v systému eShipGlobal klikněte na Upravit pod vašimi dodacími údaji. Poté aktualizujte informace o adrese a klikněte Uložit změny.

FedEx a DHL jsou autorizovaní přepravci pro zasílání výzkumných materiálů. Pokud je uvedena úplná adresa (včetně PSČ), FedEx se často zobrazí u vnitrostátních a mezinárodních zásilek. DHL se objeví u mezinárodních dodávek.

EHS zkontroluje všechny požadavky na mezinárodní přepravu před poskytnutím oprávnění pokračovat v zásilce.

Klikněte na Moje zásilky z hlavního navigačního okna eShipGlobal a poté vyberte Historie zásilky výzkumných materiálů. Chcete-li filtrovat svou historii, můžete zadat sledovací číslo přepravce, číslo objednávky eShipGlobal nebo časové období. Pak klikněte generovat.

Před odesláním jakýchkoli výzkumných materiálů mezi kampusy je nutné vyplnit online formulář „Žádost o odeslání výzkumných materiálů“. Pro přístup k formuláři prosím navštivte webové stránky Environmental Health and Safety, nebo zavolejte na číslo 203.785.3550, kde získáte další informace.

V Medical School Stockroom (Sterling Hall of Medicine, 333 Cedar Street, SHM I-E7) a Kline Biology Tower (219 Prospect Street, KBT C-11) jsou k dispozici krabice pro většinu zásilek obsahujících biologické materiály ze skladu. Dodávky jsou také dostupné ve Workday přes SciQuest.

* Přepravní spotřební materiál kategorie A nelze znovu použít.

Obraťte se prosím na Centrum finanční podpory na čísle 203 432 5394 a požádejte o pomoc při přepravě standardních vnitrostátních a mezinárodních balíků.

Máte-li jakékoli dotazy týkající se kategorizace výzkumných materiálů nebo přepravních zásilek obsahujících suchý led, kontaktujte oddělení ochrany životního prostředí a bezpečnosti na čísle 203 785 3550.

Jakmile zadáte potřebné informace pro váš letecký účet, vytisknete štítek (letecký účet) na obyčejný bílý kancelářský papír v rámci řešení eShipGlobal. Jednoduše přeložte papír napůl a vložte do plastového sáčku pouze jeden kus papíru s údaji o přepravě a máte hotovo! Formuláře nejsou vyžadovány a kopie nejsou nutné pro vnitrostátní noční dodávky. You can also email the package label to another sender.

There are two types of Return Shipments:

    If you create a shipment and want to include a prepaid airway bill for the receiver to send a package back to you.

After you create a shipment, from the shipment summary page, you have the option to create a return shipment

  • For Domestic shipments, you can do this for all Carriers and all package types
  • For International shipments, you can only do this for a FedEx Carrier Letter.

For Research Materials, you can use the Receive Research Materials From module to create the return shipment label. You can then email the shipper the airway bill from the shipment summary page.

When you create a shipment, select a Ship From (non-Yale address) and a Ship To (Yale address). You can then email the shipper the airway bill from the shipment summary page.

  • This can be done for Domestic and International shipments for all carriers and all package types.
    *Please note that some international shipments may require additional documentation that cannot be emailed to the shipper.

For Research Materials, you can use the Receive Research Materials From module to create the return shipment label. You can then email the shipper the airway bill from the shipment summary page.


Podívejte se na video: Jak získat ZDARMA SKIN ve FORTNITE (Prosinec 2022).